ड्रोसोफिला प्रणय निवेदन कंडीशनिंग: मक्खियों में सीखने और स्मृति का परीक्षण करने के लिए एक विधि

Overview

इस वीडियो में एक शास्त्रीय कंडीशनिंग परख का वर्णन किया गया है जो ड्रोसोफिलामें सीखने और स्मृति का परीक्षण करता है, जिसे प्रेमालाप कंडीशनिंग कहा जाता है। परख एक गैर ग्रहणशील पूर्वाभास महिला द्वारा एक अस्वीकृति का अनुभव करने के बाद पुरुष प्रेमालाप की कमी पर आधारित है । उदाहरण प्रोटोकॉल प्रक्रिया के लिए एक सेटअप दिखाता है जिसका उपयोग लघु और दीर्घकालिक स्मृति का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।

Protocol

यह प्रोटोकॉल कोमैंस एट अल, ड्रोसोफिला प्रेमालाप कंडीशनिंग से सीखने और स्मृति, जे विस एक्सपी (2017) के उपाय के रूप में एक अंश है।

नोट: नीचे उल्लिखित प्रोटोकॉल में, संग्रह, प्रशिक्षण और परीक्षण की एक दोहराने का वर्णन किया गया है। परिणामों की प्रजनन क्षमता का परीक्षण करने के लिए, इन चरणों को समानांतर रूप से, कई दिनों में, और मक्खियों के अलग-अलग समूहों(तालिका 1)के साथ दोहराया जाना चाहिए। प्रोटोकॉल अंडे से वयस्क के लिए एक 10 दिन के जीवन चक्र पर आधारित है, जो सामान्य है जब पालन 25 डिग्री सेल्सियस, ७०% आर्द्रता, और एक 12 घंटे प्रकाश/अंधेरे चक्र की निरंतर परिस्थितियों में मक्खियों । इस प्रोटोकॉल के सभी पहलुओं का मानना है कि शर्तों को पूरे परख में स्थिर रखा जाता है। टाइंस घंटे के रूप में संकेत दिया जाता है पहले रोशनी चालू (बीएलओ) या रोशनी चालू (ALO) इनक्यूबेटर में, के रूप में यह आसानी से दिन के शोधकर्ता पसंदीदा समय के आधार पर सेट किया जा सकता है । केवल भोले पुरुष मक्खियों के प्रारंभिक संग्रह के लिए और पूर्वनियोजित महिलाओं के संग्रह के लिए सीओ₂ गैस का उपयोग करें। प्रेमालाप कंडीशनिंग के लिए यह प्रोटोकॉल निम्नलिखित चरणों से बना है:

1. पूर्वनियोजित महिला संग्रह संस्कृतियों की स्थापना
2. पुरुष परीक्षण विषयों के संग्रह के लिए संस्कृतियों की स्थापना
3. आवास ब्लॉकों की तैयारी
4. मानकीकृत पूर्वनियोजित महिलाओं के उत्पादन के लिए संभोग शीशियों की स्थापना
5. पुरुष परीक्षण विषयों का संग्रह
6. प्रशिक्षण
7. परीक्षण
8. वीडियो डेटा विश्लेषण और आंकड़े

1. पूर्वनियोजित महिला संग्रह संस्कृतियों की स्थापना

1. पावरफूड तैयार करें। 0.8% (w/v) आगर फोड़ा, 8% (w/v) खमीर, 2% (w/v) खमीर निकालने, 2% (w/v) पेप्टोन, 3% (w/v) सुक्रोज, 6% (w/v) ग्लूकोज, ०.०५% (w/v) MgSO_4,और ०.०५% (w/v) CaCl₂ पानी में 15 मिनट के लिए । समाधान को 0.05% (w/v) मिथाइलपैराबेन(सावधानी: विषाक्त)और 0.5% (v/v) प्रोपियोनिक एसिड(सावधानी: विषाक्त)जोड़ने से पहले 70 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा होने दें। एक सजातीय समाधान प्राप्त करने के लिए 50 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करते समय सरगर्मी से अच्छी तरह से मिलाएं।
2. इससे पहले कि भोजन कमरे के तापमान पर जम जाए, प्रत्येक 175 एमएल प्लास्टिक शीशी में ~ 50 एमएल पावरफूड जोड़ें। भोजन को आगे ठंडा होने दें। शीशी को प्लग से बंद कर दो।
   नोट: पावरफूड एक विशेष खाद्य मिश्रण है जो विशेष रूप से बड़ी संख्या में मक्खियों के उत्पादन के लिए तैयार किया जाता है, संभवतः अंडे बिछाने को प्रेरित करके। पावरफूड का उपयोग पुरुष मक्खियों का उत्पादन करने के लिए नहीं किया जाता है जिसका उपयोग व्यवहार विश्लेषण (चरण 2) के लिए किया जाएगा क्योंकि असामान्य आहार और संभावित भीड़ विकास को प्रभावित कर सकती है।
3. दिन-11(तालिका 1),पावरफूड शीशियों में लगभग 60-100 मक्खियों (पुरुषों और महिलाओं का मिश्रण) के साथ 5-20 वाइल्डटाइप संस्कृतियों को शुरू करें; इनका उपयोग मानकीकृत पूर्वनियोजित महिलाओं का उत्पादन करने के लिए चरण 4 में किया जाएगा। उस क्षेत्र को बढ़ाने के लिए प्रत्येक शीशी में एक फिल्टर पेपर जोड़ें जिस पर लार्वा प्यूपेट कर सकता है; इससे मक्खियों की संख्या में वृद्धि होगी जो बंद हो सकती हैं।
4. "मानकीकृत पूर्वाभास महिलाओं के उत्पादन के लिए संभोग शीशियों की स्थापना" (चरण 4) के लिए इनपुट के रूप में पर्याप्त नए eclosing मक्खियों को प्राप्त करने के लिए प्रयोग के दौरान समय-समय पर कदम 1.1-1.3 दोहराएं।

2. पुरुष परीक्षण विषयों के संग्रह के लिए संस्कृतियों की स्थापना

1. सामान्य भोजन तैयार करें, 0.5% (w/v) आगर के साथ बनाया गया, 2.75% (w/v) खमीर, 5.2% (w/v) मकई का आटा, 11% (w/v) चीनी, 0.05% (w/v) मिथाइलपैराबेन, और पानी में 0.5% (v/v) प्रोपोनिक एसिड, जैसा कि चरण 1.1 और 1.2 में वर्णित है। एक फ्लाई शीशी प्लग के साथ 175-एमएल प्लास्टिक की शीशियों को बंद करें।
2. दिन-10(तालिका 1),सामान्य भोजन युक्त प्रत्येक 175 एमएल शीशी में लगभग 30-75 कुंवारी महिलाओं(सामग्री/उपकरण तालिका)के साथ लगभग 10-20 पुरुषों को रखें। पिल्ला के लिए सतह क्षेत्र को बढ़ाने के लिए और उत्पादकता को अधिकतम करने के लिए एक फिल्टर पेपर जोड़ें।
3. परीक्षण विषय पुरुषों की आवश्यक संख्या प्राप्त करने के लिए जीनोटाइप प्रति तीन से छह 175 एमएल शीशियों की स्थापना करें।
   नोट: वांछित जीनोटाइप की उत्पादकता के आधार पर अधिक शीशियों की आवश्यकता हो सकती है।

3. हाउसिंग ब्लॉक की तैयारी(चित्रा 2ए)

1. माइक्रोवेव में प्रति आवास ब्लॉक के लगभग 50 एमएल को पिघलाएं, या इसे ताजा तैयार करें।
2. मल्टीडिस्पनर पिपेट का उपयोग करके 96-वेल, फ्लैट-बॉटम ब्लॉक के प्रत्येक कुएं में 500 माइक्रोन जोड़ें।
3. भोजन को कमरे के तापमान पर जमना दें।
4. पीसीआर चिपकने वाली फिल्म के साथ ब्लॉक को कवर करें और मक्खियों को ताजा हवा प्रदान करने के लिए प्रति अच्छी तरह से कम से कम 4 छेद बनाने के लिए एक सुई का उपयोग करें।
5. प्रत्येक अच्छी तरह से खोलने में सक्षम होने के लिए, प्रत्येक पंक्ति के बीच चिपकने वाली फिल्म को लंबाई में काटने के लिए एक रेजर ब्लेड का उपयोग करें। फिल्म को ब्लॉक के एक छोर पर बरकरार छोड़ दें।
6. ब्लॉक को 2 दिनों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
   नोट: ब्लॉक को उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान पर फिर से बराबरी करने की अनुमति दें।

4. मानकीकृत पूर्वनियोजित महिलाओं के उत्पादन के लिए संभोग शीशियों की स्थापना

1. दिन-1 पर, 2-5 एच बीएलओ पर पूर्वनियोजित महिला संग्रह संस्कृतियों से सभी वयस्क वाइल्डटाइप मक्खियों को हटाएं और त्यागें।
2. 2-से 3-एच अंतराल(उदाहरण के लिए, 30 मिनट, 2.5 घंटे, और 5 एच एएलओ) में इन शीशियों से एस्पिरेटर(चित्रा 2बी)का उपयोग करके मक्खियों को इकट्ठा करें और उन्हें एक छोटी मात्रा में खमीर पेस्ट और फिल्टर पेपर के साथ पूरक एक नई पावरफूड शीशी में रखें।
3. भीड़ से बचने और एक इष्टतम संभोग वातावरण को बढ़ावा देने के लिए, प्रत्येक नई शीशी में 150-200 से अधिक मक्खियों को स्थानांतरित न करें। कम से कम 25% पुरुषों को प्रदान करके सभी महिलाओं का संभोग सुनिश्चित करें। सुनिश्चित करें कि प्रयोग के आकार को समायोजित करने के लिए संभोग शीशियों में पर्याप्त महिलाएं मौजूद हैं।
   नोट: चूंकि यह प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम है, इसलिए सुनिश्चित करें कि केवल हौसले से बंद मक्खियों और कोई पुरानी मक्खियों, लार्वा या पिल्ले को नई संभोग शीशी में स्थानांतरित नहीं किया जाता है।
4. सभी महिलाओं को संभोग करने के लिए पर्याप्त समय देने के लिए चार दिनों के लिए इन "संभोग शीशियों" को इनक्यूबेट करें।

5. पुरुष परीक्षण विषयों का संग्रह

1. 2-3 एच बीएलओ पर1 (टेबल 1)पर, पुरुष संग्रह शीशियों (चरण₂₎ से सभी वयस्क मक्खियों को हटाने के लिए सीओ 2 का उपयोग करें, लेकिन अगले कुछ घंटों में अधिक मक्खियों को बंद कर दें।
2. अगले 5-6 घंटे में, सीओ 2 का उपयोग करके हर 20-30 मिनट में नई eclosed मक्खियों को हटा दें और प्रत्येक पुरुष को एस्पिरेटर(चित्रा₂ बी)का उपयोग करके आवास ब्लॉक (चरण 3) के एक व्यक्ति कुएं में डाल दें।
3. चिपकने वाली पीसीआर फिल्म के साथ कुएं को फिर से सील करें।
   नोट: यह प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम है । पुरुषों को बार-बार एकत्र किया जाना चाहिए। एकत्र किए गए पुरुषों को ईक्लोज के समय के करीब आवास ब्लॉक में अलग किया जाना चाहिए, जब वे हल्के पिगमेंटेशन और पारदर्शी पेट में मेकोनियम की उपस्थिति का प्रदर्शन करते हैं।
   नोट: एस्पिरेटर का कोमल उपयोग मक्खियों के हस्तांतरण की अनुमति देता है; हालांकि, अनुचित उपयोग मक्खियों पर जोर देगा, जिससे परख में भिन्नता होगी (चर्चा देखें)।
4. जीनोटाइप प्रति 48 पुरुषों तक इकट्ठा करने का लक्ष्य रखें। यह दोनों भोली और प्रशिक्षित शर्तों के विश्लेषण के लिए आवश्यक पुरुषों की अधिकतम संख्या के लिए एक छोटे से अतिरिक्त प्रदान करता है, बाद में हस्तांतरण चरणों के दौरान कुछ नुकसान के लिए अनुमति देता है ।

6. प्रशिक्षण

1. सीओ₂ का उपयोग करके संभोग शीशी (चरण 4.2) से मक्खियों को हटा दें और पुरुषों से पूर्वनियोजित महिलाओं को अलग करें।
2. एस्पिरेटर का उपयोग करके, एक नए आवास ब्लॉक की एक पंक्ति में प्रत्येक कुएं में एक एकल एनेस्थेटाइज्ड, पूर्वनियोजित महिला जोड़ें।
3. एस्पिरेटर का उपयोग करना और संज्ञाहरण के बिना, एक व्यक्ति भोले पुरुष को आवास ब्लॉक से स्थानांतरित करें जो कदम 5.2 में स्थापित एक पूर्वनियोजित महिला से युक्त है। पुरुष को कुएं में रखने के बाद, चिपकने वाली फिल्म के साथ तुरंत फिर से सील करें; पुरुष को भागने की अनुमति न दें।
   नोट: पुरुष अपने प्राकृतिक "नकारात्मक भू-टेक्सिस" व्यवहार का लाभ उठाकर एस्पिरेटर से आवास ब्लॉक में स्थानांतरित करें।
4. पर्याप्त पुरुष-महिला जोड़े स्थापित होने तक 6.2-6.3 चरण दोहराएं। आदर्श रूप से, 24 जोड़े, एक आवास ब्लॉक की दो पूर्ण पंक्तियां, प्रति जीनोटाइप स्थापित करें। चरण 5.2 में स्थापित मूल आवास ब्लॉक में शेष भोले पुरुषों को छोड़ दें।
5. प्रशिक्षण अवधि(तालिका 2, चित्रा 1बी)के दौरान पुरुष-महिला जोड़े को अशान्त छोड़ दें ।
   नोट: इस समय के दौरान, पुरुष अदालत जाएगा और पूर्वनियोजित महिला द्वारा अस्वीकार कर दिया जाएगा। लर्निंग और एसटीएम के लिए ट्रेनिंग पीरियड 1 एच है और एलटीएम के लिए ट्रेनिंग पीरियड 7-9 घंटे है ।
6. पुरुष को पूर्वनियोजित महिला से धीरे-धीरे अलग करने के लिए एक एस्पिरेटर का उपयोग करके प्रशिक्षण(तालिका 2, चित्रा 1बी)समाप्त करें; संज्ञाहरण का उपयोग न करें। अलग हुए माले को एक नए हाउसिंग ब्लॉक में रखें।
7. एक नए आवास ब्लॉक के लिए कदम 5.2 में स्थापित आवास ब्लॉक से धीरे और संज्ञाहरण के बिना सभी भोले पुरुषों को स्थानांतरित करने के लिए एस्पिरेटर का उपयोग करें।
   नोट: यह कदम एसटीएम और सीखने के लिए वैकल्पिक है, लेकिन एलटीएम के लिए यह बहुत महत्वपूर्ण है क्योंकि मक्खियों को एलटीएम का परीक्षण करने के लिए अतिरिक्त 24 घंटे के लिए रखे जाते हैं।
8. एसटीएम और एलटीएम के लिए, पुरुषों को परीक्षण (चरण 7) से पहले क्रमशः 1 घंटे और ~ 24 घंटे(तालिका 2, चित्रा 1बी)के लिए आराम करने की अनुमति दें।
9. सीखने के लिए, तुरंत प्रशिक्षित और भोले पुरुषों (चरण 7) का परीक्षण करें।

7. परीक्षण

1. सीओ₂ का उपयोग करके संभोग शीशियों (चरण 4.2) से मक्खियों को इकट्ठा करें और पुरुषों से पूर्वनियोजित महिलाओं को अलग करें।
2. महिलाओं को सामान्य भोजन युक्त शीशी में कम से कम 1 घंटे के लिए संज्ञाहरण से ठीक होने दें।
3. परीक्षण शुरू होने से पहले सभी उपकरण तैयार करने के लिए वीडियो रिकॉर्डर को पहले से माउंट करें(चित्रा 2सी)।
4. लर्निंग, एसटीएम और एलटीएम(टेबल 2, फिगर 1बी)के लिए अलग-अलग समयसीमा के अनुसार टेस्टिंग शुरू करें। सीखने के लिए प्रशिक्षण के तुरंत बाद परीक्षण करें, एसटीएम के लिए प्रशिक्षण के बाद 1 घंटे, और एलटीएम के लिए प्रशिक्षण के बाद 24 घंटे।
5. एस्पिरेटर का उपयोग करके, धीरे-धीरे एक व्यक्तिगत पुरुष को आराम आवास ब्लॉक से या प्रशिक्षण आवास ब्लॉक से स्थानांतरित करें यदि सीखने का परीक्षण किया जा रहा है (चरण 6.7, प्रशिक्षित; चरण 6.8, भोली) डिवाइडर बंद के साथ एक प्रेमालाप क्षेत्र के एक आधे हिस्से में(चित्रा 2डी;एक इमारत योजना के लिए फ़ाइल S1 देखें)।
   नोट: प्राकृतिक "नकारात्मक भू-टैक्सिस" व्यवहार का उपयोग एस्पिरेटर से प्रेमालाप क्षेत्र में पुरुष मक्खियों को स्थानांतरित करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए।
6. जल्दी से लेकिन धीरे से अगले क्षेत्र के लिए प्रवेश छेद ले जाएँ और सभी 18 एरेनास एक पुरुष होते हैं जब तक कदम 7.5 दोहराने.
7. एस्पिरेटर का उपयोग करना और सीओ₂के बिना, सभी 18 एरेनास के दूसरे आधे हिस्से में एक पूर्वनियोजित महिला (चरण 7.2 में एकत्र) जोड़ें।
8. ध्यान से कैमरे के नीचे प्रणय निवेदन कक्ष जगह, नीचे का सामना करना पड़ कुओं के उद्घाटन के साथ(चित्रा 2सी)।
9. पुरुषों और पूर्वनियोजित महिलाओं के बीच सीधी बातचीत की अनुमति देने के लिए एरेनास के डिवाइडर को हटा दें।
10. तुरंत कम से कम 10 मिनट के लिए व्यवहार रिकॉर्डिंग शुरू करते हैं।
    नोट: दो-कैमरा सेटअप का उपयोग करते समय, दक्षता को अधिकतम करने के लिए दो प्रेमालाप प्लेटों की समानांतर रिकॉर्डिंग ओवरलैपिंग टाइमफ्रेम में की जा सकती है।
11. हाथ से आयोजित वैक्यूम क्लीनर का उपयोग करके प्रेमालाप एरेनास को खाली करें और प्रेमालाप कक्ष को फिर से उपयोग करने से पहले हवादार करने की अनुमति दें।
12. सभी जीनोटाइप और शर्तों(यानी, भोले और प्रशिक्षित) का परीक्षण पूरा होने तक दोहराएं चरण 7.4-7.11।

8. वीडियो डेटा विश्लेषण और सांख्यिकी

1. प्रत्येक पुरुष फ्लाई के लिए, परीक्षण अवधि के पहले 10 मिनट के दौरान पुरुष अदालतों के समय के प्रतिशत के रूप में परिभाषित प्रणय सूचकांक (सीआई) की गणना करें।
   नोट: यह टकसाली प्रणय व्यवहार(चित्रा 1ए)या प्रणय व्यवहार के स्वचालित मात्राकरण के लिए कंप्यूटर सॉफ्टवेयर का उपयोग करके मैन्युअल रूप से किया जा सकता है।
   नोट: पर्याप्त सांख्यिकीय शक्ति प्राप्त करने और सीआई डेटा की निरंतरता का न्याय करने के लिए तीन दिनों के दौरान प्रति शर्त 40-60 पुरुषों का विश्लेषण करने की सिफारिश की जाती है।
2. सीखने सूचकांक (LI), भोले पुरुषों की तुलना में प्रशिक्षित पुरुषों के मतलब सीआई में प्रतिशत की कमी के रूप में परिभाषित की गणना (ली = (CI_{भोली-CI प्रशिक्षित)/CIभोली)}। परीक्षण के प्रत्येक दिन के लिए ली का मूल्यांकन करें और संयुक्त सभी परीक्षण दिनों से गणना संचयी ली से तुलना करें।
3. हेडर के रूप में "जीनोटाइप" और "सीआई" के साथ एक अलग दो-कॉलम टैब डेटा फ़ाइल बनाएं।
   नोट: ये शीर्षक मामले संवेदनशील हैं। प्रत्येक सीआई के लिए जीनोटाइप का नाम जीनोटाइप का विवरण होना चाहिए जिसके बाद एक अंडरस्कोरल और प्रशिक्षण स्थिति(उदाहरण के लिए, genotype_N और genotype_LTM, आदि, जहां एन = भोले और LTM = दीर्घकालिक स्मृति; एक उदाहरण के लिए पूरक फ़ाइल S2 देखें)। यह एनोटेशन आवश्यक है, क्योंकि फ़ंक्शन एनाल् फिरन "जीनोटाइप" कॉलम में पहले रेखांकित करने के बाद मौजूद पात्रों के आधार पर प्रशिक्षित और भोले मक्खियों की पहचान करेगा।
4. विभिन्न जीनोटाइप से ली मूल्यों के बीच मतभेदों के सांख्यिकीय महत्व का न्याय करने के लिए यादृच्छिकता परीक्षण करने के लिए एनालर्न आर स्क्रिप्ट (पूरक फ़ाइल S3) का उपयोग करें।
   1. स्क्रिप्ट (पूरक फ़ाइल S3) को आर में स्रोत करें, जो "एनाल्अर्न" नामक एक फ़ंक्शन को परिभाषित करता है।
      नोट: समारोह परिभाषा है: analearn <- फ़ंक्शन (nboot = 10,000, भोलेलेवल = 'एन', पुनर्संरचना = एनए, datname = NA, हेडर = TRUE, बीज = ना, writeoutput = सच) ।
   2. आर कमांड लाइन में "एनालर्न ()) दर्ज करके और पॉप-अप विंडो के माध्यम से विश्लेषण (चरण 8.3 में उत्पादित) डेटा फ़ाइल का चयन करके फ़ंक्शन शुरू करें।
   3. संदर्भ उत्परिवर्तन चुनें, जो नियंत्रण जीनोटाइप है, इसी नंबर में प्रवेश करके और दबाने के द्वारा दर्ज करें।
      नोट: संदर्भ जीनोटाइप का चयन करने के बाद, स्क्रिप्ट को 10,000 बूटस्ट्रैप प्रतिकृति प्रदर्शन करने में कई सेकंड लगते हैं।
   4. आउटपुट टेबल (तालिका 3) का निरीक्षण करें, जिसमें जीनोटाइप, लर्निंग कंडीशन(यानी,लर्निंग, एसटीएम या एलटीएम) शामिल है, मतलब सीआई भोली, मतलब सीआई प्रशिक्षित, ली, प्रायोगिक स्थिति (ली डिफ), एलआई डीआईएफ के 95% विश्वास अंतराल की कम सीमा (एलएल) और ऊपरी सीमा (यूएल) की तुलना में नियंत्रण की एलआई के बीच अंतर, और पी-वैल्यू
      नोट: एनालर्न निर्देशिका में एक आउटपुट टेक्स्ट फ़ाइल संग्रहीत करेगा जहां डेटा फ़ाइल स्थित है। हालांकि, आउटपुट टेबल आर-स्टूडियो कंसोल में भी दिखाई देता है। तयशुदा नाम का निर्माण उपलब्ध कराई गई डेटा फाइल के नाम के आधार पर किया जाता है।
   5. एनाल् फिरन फ़ंक्शन में कई तर्क हैं जिनका उपयोग बूटस्ट्रैपिंग के मापदंडों को समायोजित करने के लिए फ़ंक्शन की डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स को बदलने के लिए किया जा सकता है।
      नोट: "nboot" बूटस्ट्रैप प्रतिकृति की संख्या को परिभाषित करता है और डिफ़ॉल्ट रूप से 10,000 करने के लिए सेट है। इस मान को शून्य से बड़े किसी भी पूर्णांक संख्या में बदला जा सकता है। तालिका 5 में कई तर्कों को सूचीबद्ध किया गया है जिनका उपयोग फ़ंक्शन की डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स को बदलने के लिए किया जा सकता है। हालांकि, कम संख्या में बूटस्ट्रैप प्रतिकृति के साथ उत्पादित डेटा का उपयोग करने की सिफारिश नहीं की जाती है।

Representative Results

चित्रा 1: प्रणय सूचकांक और प्रयोगात्मक अवलोकन का निर्धारण। (क)एक महिला मक्खी के प्रति टकसाली पुरुष प्रणय व्यवहार दिखा छवियां । प्रेमालाप व्यवहार के विभिन्न चरणों को दिखाया गया है: अभिविन्यास (I), निम्नलिखित (II), विंग कंपन (विस्तार) और टैपिंग (III), चाट (IV), और मैथुन (वी) का प्रयास किया जाता है। (ख)इनक्यूबेटर प्रकाश चक्र के सापेक्ष प्रशिक्षण और परीक्षण के समय का योजनाबद्ध अवलोकन, घंटों में चिह्नित। प्रशिक्षण समय सलाखों के साथ इंगित कर रहे हैं, एसटीएम और LTM के लिए आराम अवधि एक धराशायी लाइन के साथ संकेत दिया जाता है, और परीक्षण शुरू बिंदु एक तीर के रूप में संकेत दिया है । ध्यान रहे कि एलटीएम के लिए परीक्षण का समय प्रशिक्षण के बाद का दिन है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 2: ड्रोसोफिला प्रेमालाप कंडीशनिंग परख के लिए उपयोग किए जाने वाले उपकरण। }ए)हाउसिंग ब्लॉक एक फ्लैट, बॉटम ब्लॉक है, जिसमें 500 माइक्रोन पावरफूड प्रति कुएं है। यह एक क्यूपीसीआर चिपकने वाली फिल्म के साथ बंद कर दिया गया है जिसमें कम से कम 4 छेद प्रति कुएं हैं जो 0.8 मिमी व्यास के साथ सिरिंज सुई का उपयोग करके बनाए गए थे। अलग-अलग पंक्तियों को खोलने और बंद करने की अनुमति देने के लिए रेजर ब्लेड का उपयोग करके स्ट्रिप्स में लंबाई में कटौती की जाती है। (ख)संज्ञाहरण के उपयोग के बिना पुरुष और मादा मक्खियों के कोमल हस्तांतरण के लिए एस्पिरेटर की आवश्यकता होती है। इनसेट एस्पिरेटर की नोक को दिखाता है, मक्खियों को टिप के भीतर रखने के लिए कपास के एक टुकड़े के साथ बंद कर दिया जाता है। (ग)दो प्रेमालाप कक्षों की एक साथ रिकॉर्डिंग के लिए दो कैमरे की प्रणाली का सेटअप । (घ)18 एरेनास के साथ एक प्रणय निवेदन कक्ष । फिसलने प्रवेश छेद एरेनास में मक्खियों जगह करने के लिए उपयोग किया जाता है। पुरुषों और महिलाओं के बीच बातचीत शुरू करने के लिए सफेद डिवाइडर को एक साथ खोला जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

तालिका 1: व्यक्तिगत दिनों में तीन प्रतिकृति पर एलटीएम के परीक्षण के लिए उदाहरण समय रेखा।

	सामान्य	इकट्ठा	ट्रेन	परीक्षा
दिन -11	पूर्वनियोजित महिला संग्रह संस्कृतियों शुरू करें (चरण 1.3)
दिन -10	पुरुष परीक्षण विषयों के संग्रह के लिए संस्कृतियों शुरू (चरण 2.2)
पहला दिन		प्रतिनिधि 1
दूसरा दिन		प्रतिनिधि 2
तीसरा दिन		प्रतिनिधि 3
दूसरा दिन		प्रतिनिधि 4	प्रतिनिधि 1
5 दिन			प्रतिनिधि 2	प्रतिनिधि 1
दूसरा दिन			प्रतिनिधि 3	प्रतिनिधि 2
दिन 7			प्रतिनिधि 4	प्रतिनिधि 3
दिन 8				प्रतिनिधि 4
9 दिन	वीडियो डेटा विश्लेषण और आंकड़े (चरण 8)
प्रतिनिधि = दोहराने

तालिका 2: प्रशिक्षण अवधि, प्रशिक्षण समय, और सीखने के लिए परीक्षण टाइंस, STM, और LTM

	सीख	एसटीएम	एलटीएम
प्रशिक्षण का समय	1 घंटे।	1 घंटे।	8 घंटे।
आराम का समय	0 एच।	1 घंटे।	~ 24 घंटे।
प्रशिक्षण शुरू	0 एच एओआई	0 एच एओआई	4 घंटे बीएलओ
प्रशिक्षण रोकना	1 घंटे एओआई	1 घंटे एओआई	4 घंटे एओआई
प्रारंभ परीक्षण	1 घंटे एओआई	2 घंटे एओआई	0 एच एओ (अगले दिन)
ALO = रोशनी चालू होने के बाद, बीएलओ = रोशनी चालू होने से पहले, एसटीएम = अल्पकालिक स्मृति, एलटीएम = दीर्घकालिक स्मृति

तालिका 3: एनालर्न स्क्रिप्ट से उत्पादित सांख्यिकीय डेटा।
एनालर्न स्क्रिप्ट से उत्पादित सांख्यिकीय डेटा। जीनोटाइप युक्त बूटस्ट्रैपिंग आर-स्क्रिप्ट की आउटपुट फाइल, लर्निंग कंडीशन(यानी,लर्निंग, एसटीएम, या एलटीएम), मतलब सीआई भोली, मतलब सीआई प्रशिक्षित, ली, प्रायोगिक स्थिति (LI dif), एलआई डिफ की तुलना में नियंत्रण की ली के बीच अंतर, एलआई डिफ के 95% कॉन्फिडेंस इंटरवल की निचली सीमा (एलएल) और ऊपरी सीमा (यूएल) और पी-वैल्यूइस बात का संकेत देता है कि कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं है।

जीनोटाइप	सीख	सीआई	सीआई	ली	ली	कम सीमा	ऊपरी सीमा	पी-वैल्यू
	हालत	अनुभवहीन	प्रशिक्षित		अंतर	(95% सम्मेलन अंतराल)	(95% सम्मेलन अंतराल)
नियंत्रण	एसटीएम	0.467	0.116	0.752	ना	ना	ना	ना
धाप-एट-आरएनएआई	एसटीएम	0.699	0.257	0.633	0.119	-0.03	0.265	0.116
नियंत्रण	एलटीएम	0.59	0.384	0.348	ना	ना	ना	ना
धाप-एट-आरएनएआई	एलटीएम	0.697	0.65	0.068	0.28	0.103	0.446	0.003

पूरक फ़ाइल S1: एक प्रेमालाप कक्ष की योजना का निर्माण। फाइल को किसी भी एप्लिकेशन के साथ खोला जा सकता है जो .stp एक्सटेंशन (सीएडी-फाइल) की अनुमति देता है। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल S2: Analearn स्क्रिप्ट के लिए एक इनपुट फ़ाइल का उदाहरण। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल S3: Analearn.r स्क्रिप्ट। फाइल को आर-स्टूडियो के साथ खोला जा सकता है। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
P{KK101437}VIE-260B	VDRC	101437	Dhat-at-RNAi in 60100 background
P{KK108109}VIE-260B	-	-	Control-RNAi in 60100 background (gift from K. Keleman)
w+, UAS-dcr2/yhh;;elav-Gal4 (III)	-	-	panneuronal driver line
Containers for plant tissue culture	VWR	960177	175 mL plastic vials
Folded filters	Whatman	10311643	Filter paper to enlarge area flies can pupate on
Flat-bottom blocks (96-wells)	Qiagen	19579	Used for housing blocks
MicroAmp Clear Adhesive Film	Applied Biosystems	4306311	PCR adhesive film as lid on flat-bottom blocks
Razor blade	-	-	Any sharp will do
Needle	-	-	0.8 mm diameter
Aspirator	-	-	Cut a 1mL pipet tip with scissors in order to have two pieces. The narrow tip of the pipettip is placed as fly entrance in a ~80 cm flexible hose. To prevent a fly from getting in the hose, a normal piece of cotton or small mesh gaze is placed in between the tip and the hose. The other half of the pipettip can be used as mouth piece at the end of the hose.
Courtship chambers	-	-	file S1 can be opened with indicated CAD software
Camcorder	Sony	-	camera specification: >4M pixels, full HD.
For manual quantification, any simple video recording device has the potential to produce a video of sufficient quality to observe courtship behavior accurately. For automated quantification, there will likely be different requirements depending on the software to be used, and users should investigate this thoroughly if automated quantification is desired.
Name	Company	Catalog Number	Comments
power food
Agar	Sigma	A7002
Yeast	Bruggeman	-
Yeast extract	MP biomedicals	0210330391
Peptone	Sigma	P6838
Sucrose	Sigma	S9378
Glucose	Sigma	G7021
MgSO4	Sigma	M2643
CaCl2	Merck	1023780500
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	-
Yeast paste	-		yeast grains and water mixture in a 1:1 ratio
Name	Company	Catalog Number	Comments
normal food
Agar	MP biomedicals	215017890
Yeast	bruggeman	-
Corn flour	de Molen	-
Sugar	de Molen	-
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	-