Drosofilia Condizionamento del corteggiamento: un metodo per testare l'apprendimento e la memoria nelle mosche

Overview

Questo video descrive un classico saggio di condizionamento che testa l'apprendimento e la memoria in Drosophila, chiamato condizionamento del corteggiamento. Il saggio si basa sulla riduzione del corteggiamento maschile dopo aver subito un rifiuto da parte di una femmina premated non ricettiva. Il protocollo di esempio mostra una configurazione per la procedura che può essere utilizzata per valutare la memoria a breve e lungo termine.

Protocol

Questo protocollo è un estratto da Koemans et al., Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory, J. Vis. Exp.

NOTA: Nel protocollo descritto di seguito viene descritta una replica di raccolta, training e test. Per verificare la riproducibilità dei risultati, questi passaggi devono essere ripetuti in parallelo, in più giorni e con gruppi separati di mosche (Tabella 1). Il protocollo si basa su un ciclo di vita di 10 giorni dall'uovo all'adulto, che è normale quando si allevano mosche in condizioni costanti di 25 °C, umidità del 70% e un ciclo chiaro / scuro di 12 ore. Tutti gli aspetti di questo protocollo presuppongono che le condizioni siano mantenute costanti durante l'intero saggio. Gli orari sono indicati come ore prima che le luci si accendono (BLO) o dopo che le luci si accendono (ALO) nell'incubatore, in quanto questo può essere convenientemente impostato a seconda dell'ora di giornata preferita dal ricercatore. Utilizzare gas CO₂ solo per la raccolta iniziale di mosche maschili ingenua e per la raccolta di femmine premated. Questo protocollo per il condizionamento del corteggiamento è composto dai seguenti passaggi:

1. Creazione di culture di raccolta femminile premated
2. Creazione di culture per la raccolta di soggetti di prova maschili
3. Preparazione di blocchi abitativi
4. Creazione di fiale di accoppiamento per la produzione di femmine standardizzate premated
5. Raccolta di soggetti di prova maschili
6. formazione
7. collaudo
8. Analisi e statistiche dei dati video

1. Istituzione di culture di raccolta femminile premated

1. Prepara il powerfood. Far bollire 0,8% (con v) agar, 8% (w/v) lievito, 2% (w/v) estratto di lievito, 2% (w/v) peptone, 3% (w/v) saccarosio, 6% (w/v) glucosio, 0,05% (w/v) MgSO₄e 0,05% (w/v) CaCl₂ in acqua per 15 min. Lasciare raffreddare la soluzione a 70 °C prima di aggiungere lo 0,05% (v/v) metilparabene (ATTENZIONE:tossico ) e lo 0,5% (v/v) acido propionico (ATTENZIONE: tossico). Mescolare bene mescolando mentre si raffredda ulteriormente fino a 50 °C per ottenere una soluzione omogenea.
2. Prima che il cibo si solidifichi a temperatura ambiente, aggiungere ~ 50 mL di powerfood a ogni flaconcino di plastica da 175 mL. Lasciare raffreddare ulteriormente il cibo. Chiudere il flaconcino con una spina.
   NOTA: Powerfood è una miscela alimentare specializzata formulata specificamente per la produzione di un gran numero di mosche, presumibilmente inducendo la deposizione delle uova. Powerfood non viene utilizzato per produrre mosche maschili che verranno utilizzate per l'analisi del comportamento (fase 2) perché la dieta atipica e il potenziale affollamento potrebbero influenzare lo sviluppo.
3. Il giorno -11(tabella 1),inizia 5-20 colture di tipo selvatico con circa 60-100 mosche (un mix di maschi e femmine) in fiale powerfood; questi saranno utilizzati nella fase 4 per produrre femmine standardizzate premated. Aggiungere una carta da filtro a ogni flaconcino per aumentare l'area su cui le larve possono impuparsi; questo aumenterà il numero di mosche che possono precludere.
4. Ripetere periodicamente i passaggi 1.1-1.3 durante l'esperimento per ottenere un numero sufficiente di mosche appena echiuse come input per la "creazione di fiale di accoppiamento per la produzione di femmine prematizzate standardizzate" (fase 4).

2. Istituzione di culture per la raccolta di soggetti di prova maschili

1. Preparare cibo normale, fatto con agar 0,5% (con v), 2,75% (w/v) lievito, 5,2% (w/v) farina di mais, 11% (w/v) zucchero, 0,05% (con v) metilparabene e 0,5% (v/v) acido propionico in acqua, come descritto nei passaggi 1.1 e 1.2. Chiudere i flaconcini di plastica da 175 mL con un tappo a flaconcino a mosca.
2. Il giorno -10(tabella 1),posizionare circa 10-20 maschi con circa 30-75 femmine vergini(tabella materiali/attrezzature)in ogni flaconcino da 175 mL contenente cibo normale. Aggiungere una carta da filtro per aumentare l'area della superficie per la pupa e massimizzare la produttività.
3. Stabilire da tre a sei flaconcini da 175 mL per genotipo per ottenere il numero richiesto di maschi soggetti di prova.
   NOTA: Potrebbero essere necessarie più fiale, a seconda della produttività del genotipo desiderato.

3. Preparazione di blocchi abitativi(figura 2A)

1. Sciogliere circa 50 mL di powerfood per blocco abitativo in un forno a microonde o prepararlo fresco.
2. Aggiungere 500 μL di powerfood a ciascun pozzo di un blocco a fondo piatto da 96 poggia-poggiante utilizzando una pipetta multidispenser.
3. Lasciare che il cibo si solidifichiamo a temperatura ambiente.
4. Coprire i blocchi con pellicola adesiva PCR e utilizzare un ago per realizzare almeno 4 fori per pozzo per fornire aria fresca alle mosche.
5. Per poter aprire ogni pozzo, utilizzare una lama di rasoio per tagliare la pellicola adesiva longitudinalmente tra ogni riga. Lasciare il film intatto su un'estremità del blocco.
6. I blocchi possono essere conservati a 4 °C per un massimo di 2 giorni.
   NOTA: Lasciare che i blocchi si rialibrano a temperatura ambiente prima dell'uso.

4. Istituzione di fiale di accoppiamento per la produzione di femmine standardizzate premated

1. Il giorno -1, rimuovere e scartare tutte le mosche wildtype adulte dalle colture di raccolta femminile premated a 2-5 h BLO.
2. Raccogliere le mosche utilizzando l'aspiratore (Figura 2B) da queste fiale in intervalli da 2 a 3 ore(ad esempio, a 30 minuti, 2,5 ore e 5 h DIO) e posizionarle in una nuova fiala powerfood integrata con una piccola quantità di pasta di lievito e carta da filtro.
3. Per evitare l'affollamento e promuovere un'atmosfera di accoppiamento ottimale, non trasferire più di 150-200 mosche su ogni nuova fiala. Assicurarsi l'accoppiamento di tutte le femmine fornendo almeno il 25% di maschi. Assicurarsi che nelle fiale di accoppiamento siano presenti femmine sufficienti per adattarsi alle dimensioni dell'esperimento.
   NOTA: Poiché questo è un passo cruciale nel protocollo, assicurati che solo le mosche appena racchiuse e nessuna vecchia mosca, larve o pupe venga trasferita alla nuova fiala di accoppiamento.
4. Incubare queste "fiale di accoppiamento" per quattro giorni per consentire a tutte le femmine di accoppiarsi.

5. Raccolta di soggetti di prova maschili

1. Il primo giorno (Tabella 1) a 2-3 h BLO, utilizzare CO₂ per rimuovere tutte le mosche adulte dalle fiale di raccolta maschile (passo 2), ma lasciare che più mosche si racchiudono nelle prossime ore.
2. Nei successivi 5-6 ore, rimuovere le mosche appena echiuse ogni 20-30 minuti usando CO₂ e mettere ogni maschio in un singolo pozzo del blocco abitativo (fase 3) utilizzando l'aspiratore(Figura 2B).
3. Sigillare il pozzo con la pellicola PCR adesiva.
   NOTA: Si tratta di un passo cruciale nel protocollo. I maschi dovrebbero essere raccolti frequentemente. I maschi raccolti dovrebbero essere isolati nel blocco abitativo vicino al momento dell'eclosion, quando dimostrano la pigmentazione pallida e la presenza del meconio nell'addome traslucido.
   NOTA: L'uso delicato dell'aspiratore consente il trasferimento di mosche; tuttavia, l'uso inappropriato stresserà le mosche, causando varianza nel saggio (vedi la discussione).
4. Mira a raccogliere fino a 48 maschi per genotipo. Ciò fornisce un piccolo eccesso al numero massimo di maschi necessario per l'analisi delle condizioni sia ingenui che addestrate, consentendo una certa perdita durante le fasi successive del trasferimento.

6. Formazione

1. Rimuovere le mosche dal flaconcino di accoppiamento (fase 4.2) usando CO₂ e separare le femmine premated dai maschi.
2. Utilizzando l'aspiratore, aggiungere una singola femmina anestetizzata e premated a ogni pozzo in una fila di un nuovo blocco abitativo.
3. Utilizzando l'aspiratore e senza anestesia, trasferire un singolo maschio ingenuo dal blocco abitativo allestito nel passaggio 5.2 al pozzo contenente una femmina premated. Dopo che il maschio è stato posto nel pozzo, sigillare immediatamente con la pellicola adesiva; non permettere al maschio di fuggire.
   NOTA: Trasferisci le mosche maschili dall'aspiratore al blocco abitativo sfruttando il loro naturale comportamento di "geotassi negativa".
4. Ripetere i passaggi 6.2-6.3 fino a quando non vengono stabilite abbastanza coppie maschio-femmina. Idealmente, stabilire 24 coppie, due file complete di un blocco abitativo, per genotipo. Lasciare i restanti maschi ingenui nel blocco abitativo originale allestito nel passaggio 5.2.
5. Lasciare indisturbate le coppie uomo-femmina durante il periodo diallenamento (tabella 2 , figura 1B).
   NOTA: Durante questo periodo, il maschio corteggia e sarà respinto dalla femmina premated. Per l'apprendimento e l'STM, il periodo di formazione è di 1 h e per la LTM, il periodo di formazione è di 7-9 ore.
6. Terminare l'allenamento(tabella 2, figura 1B) utilizzando un aspiratore per separare delicatamente il maschio dalla femmina premated; non usare l'anestesia. Posizionare il maschio separato in un nuovo blocco abitativo.
7. Utilizzare l'aspiratore per trasferire tutti i maschi ingenui delicatamente e senza anestesia dal blocco abitativo allestito nel passaggio 5.2 a un nuovo blocco abitativo.
   NOTA: Questo passaggio è facoltativo per STM e apprendimento, ma è molto importante per la LTM perché le mosche sono alloggiate per altri 24 h per testare la LTM.
8. Per STM e LTM, consentire ai maschi di riposare rispettivamente per 1 h e ~24 h (Tabella 2, Figura 1B) prima della prova (fase 7).
9. Per l'apprendimento, testare immediatamente i maschi addestrati e ingenui (fase 7).

7. Prove

1. Raccogli le mosche dalle fiale di accoppiamento (passo 4.2) usando CO₂ e separa le femmine premated dai maschi.
2. Lasciare che le femmine si riprendano dall'anestesia per almeno 1 h in una fiala contenente cibo normale.
3. Montare i videoregistratori in anticipo (Figura 2C), per avere tutte le apparecchiature pronte prima dell'inizio della prova.
4. Avviare il test in base alle diverse tempistiche per l'apprendimento, STM e LTM (Tabella 2, Figura 1B). Eseguire test immediatamente dopo l'allenamento per l'apprendimento, 1 h dopo l'allenamento per STM e 24 ore dopo l'allenamento per LTM.
5. Utilizzando l'aspiratore, trasferire delicatamente un singolo maschio dal blocco abitativo di riposo o dal blocco abitativo di formazione se l'apprendimento è in fase di test (fase 6.7, addestrato; passo 6.8, ingenuo) a metà di un'arena di corteggiamento con il divisore chiuso(Figura 2D;vedi File S1 per un piano edilizio).
   NOTA: L'uso del naturale comportamento "geotassi negativa" dovrebbe essere sufficiente per trasferire le mosche maschili dall'aspiratore all'arena di corteggiamento.
6. Sposta rapidamente ma delicatamente il buco d'ingresso nell'arena successiva e ripeti il passo 7.5 fino a quando tutte le 18 arene contengono un maschio.
7. Utilizzando l'aspiratore e senza CO₂, aggiungere una femmina premated (raccolta nel passaggio 7.2) all'altra metà di tutte le 18 arene.
8. Posizionare con cura la camera di corteggiamento sotto la telecamera, con l'apertura dei pozzi rivolti verso il basso(Figura 2C).
9. Rimuovere il divisore delle arene per consentire l'interazione diretta tra i maschi e le femmine premated.
10. Iniziare immediatamente a registrare il comportamento per almeno 10 minuti.
    NOTA: Quando si utilizza una configurazione a due telecamere, la registrazione parallela di due piastre di corteggiamento può essere eseguita in tempi sovrapposti per massimizzare l'efficienza.
11. Svuotare le arene di corteggiamento utilizzando un aspirapolvere attraverso un aspirapolvere attraverso la mano e consentire alla camera di corteggiamento di ventilare prima del nuovo utilizzo.
12. Ripetere il passaggio 7.4-7.11 fino al completamento della provadi tutti i genotipi e condizioni (cioè ingenui e addestrati).

8. Analisi e statistica dei dati video

1. Calcola l'indice di corteggiamento (CI), definito come la percentuale di tempo che i tribunali maschi durante i primi 10 minuti del periodo di prova, per ogni singolo maschio volano.
   NOTA: Questo può essere fatto manualmente osservando il comportamento di corteggiamento stereotipato (Figura 1A) o utilizzando software per computer per la quantificazione automatizzata del comportamento di corteggiamento.
   NOTA: Si raccomanda di analizzare 40-60 maschi per condizione nel corso di tre giorni al fine di ottenere un potere statistico sufficiente e giudicare la coerenza dei dati CI.
2. Calcolare l'indice di apprendimento (LI), definito come la riduzione percentuale dell'CI media dei maschi addestrati rispetto ai maschi ingenui (LI = (CI_naïve – CI_addestrato) / CI_ingenuo). Valutare l'LI per ogni giorno di test e confrontarlo con il LI cumulativo calcolato da tutti i giorni di test combinati.
3. Creare un file di dati di tabulazione a due colonne separato con "Genotype" e "CI" come intestazioni.
   NOTA: Queste rubriche fanno la parte del caso. Il nome del genotipo per ogni CI deve consistere in una descrizione del genotipo seguita da un carattere di sottolineatura e dalla condizione di allenamento(ad esempio, genotype_N e genotype_LTM, ecc., dove N = ingenuo e LTM = memoria a lungo termine; vedere ad esempio il file supplementare S2). Questa annotazione è essenziale, in quanto la funzione analearn identificherà mosche addestrate e ingenue in base ai caratteri presenti dopo il primo carattere di sottolineatura nella colonna "Genotipo".
4. Utilizzare lo script Analearn R (Supplemental File S3) per eseguire un test di randomizzazione per giudicare la significatività statistica delle differenze tra i valori LI dei diversi genotipi.
   1. Source lo script (Supplemental File S3) in R, che definisce una funzione chiamata "analearn".
      NOTA: La definizione della funzione è: analearn <- function(nboot = 10.000, naivelevel = 'N', refmutation = NA, datname = NA, header = TRUE, seed = NA, writeoutput = TRUE).
   2. Avviare la funzione immettendo "analearn()" nella riga di comando R e selezionando il file di dati da analizzare (prodotto nel passaggio 8.3) tramite la finestra popup.
   3. Scegliere la mutazione di riferimento, che è il genotipo di controllo, immettendo il numero corrispondente e premendo INVIO.
      NOTA: Dopo aver selezionato il genotipo di riferimento, lo script impiega diversi secondi per eseguire 10.000 repliche di bootstrap.
   4. Osservare la tabella di output (tabella 3), che contiene il genotipo, la condizione di apprendimento ( cioè , apprendimento, STM o LTM), significa CI ingenua, media CI addestrata, LI, la differenzatra l'LIdel controllo rispetto alla condizione sperimentale (LI dif), il limite inferiore (LL) e il limite superiore (UL) dell'intervallo di confidenza del 95% del dif LI e il valore pche indica la probabilità che non vi sia alcuna differenza significativa.
      NOTA: analearn memorizza un file di testo di output nella directory in cui si trova il file di dati. Tuttavia, la tabella di output viene visualizzata anche nella console di R-Studio. Il nome predefinito viene costruito in base al nome del file di dati fornito.
   5. Esistono diversi argomenti nella funzione analearn che possono essere utilizzati per modificare le impostazioni predefinite della funzione per regolare i parametri del bootsstrapping.
      NOTA: "nboot" definisce il numero di repliche di bootstrap ed è impostato su 10.000 per impostazione predefinita. Questo valore può essere modificato in qualsiasi numero intero maggiore di zero. Nella tabella 5 sono stati utilizzati diversi argomenti che possono essere utilizzati per modificare le impostazioni predefinite della funzione. Tuttavia, non è consigliabile utilizzare i dati prodotti con un basso numero di repliche bootstrap.

Representative Results

Figura 1: Determinazione dell'indice di corteggiamento e panoramica sperimentale. (A) Immagini che mostrano un comportamento stereotipato del corteggiamento maschile nei confronti di una mosca femminile. Vengono mostrate diverse fasi del comportamento del corteggiamento: orientamento (I), seguito (II), vibrazione alare (estensione) e maschiatura (III), leccare (IV) e tentare la copulazione (V). (B) Panoramica schematica dei tempi di allenamento e di prova relativi al ciclo di luce dell'incubatore, contrassegnati in ore. I tempi di allenamento sono indicati con barre, i periodi di riposo per STM e LTM sono indicati con una linea tratteggiata e il punto di partenza del test è indicato come freccia. Si noti che il tempo di test per la LTM è il giorno dopo l'allenamento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Attrezzature utilizzate per il saggio di condizionamento del corteggiamento di Drosophila. (A) Il blocco abitativo è un blocco inferiore piatto con 500 μL di powerfood per pozzo. È sigillato con una pellicola adesiva qPCR con almeno 4 fori per pozzo che sono stati creati utilizzando un ago per siringa con un diametro di 0,8 mm. Le singole file vengono tagliate longitudinalmente in strisce utilizzando una lama di rasoio per consentire l'apertura e la chiusura. (B) L'aspiratore è necessario per il delicato trasferimento di mosche maschili e femminili senza l'uso di anestesia. L'inserto mostra la punta dell'aspiratore, chiuso con un pezzo di cotone per mantenere le mosche all'interno della punta. (C) Installazione di un sistema a due telecamere per la registrazione simultanea di due sezioni di corteggiamento. (D) Una camera di corteggiamento con 18 arene. I fori di ingresso scorrevoli vengono utilizzati per posizionare le mosche nelle arene. I divisori bianchi possono essere aperti contemporaneamente per iniziare l'interazione tra maschi e femmine. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Sequenza temporale di esempio per il test della LTM su tre repliche nei singoli giorni.

	Generale	raccogliere	treno	test
giorno -11	Inizia le culture di raccolta femminile premated (passaggio 1.3)
giorno -10	Iniziare le colture per la raccolta di soggetti di prova maschili (fase 2.2)
giorno 1		1
giorno 2		2
giorno 3		3
giorno 4		4	1
giorno 5			2	1
giorno 6			3	2
giorno 7			4	3
giorno 8				4
giorno 9	Analisi e statistiche dei dati video (fase 8)
rep = ripeti

Tabella 2: Durata dell'allenamento, tempi di allenamento e tempi di test per apprendimento, STM e LTM

	apprendimento	Stm	LTM
Tempo di allenamento	1 h.	1 h.	8 ore.
Tempo di riposo	0 h.	1 h.	~ 24 ore su 24.
iniziare l'allenamento	0 h. ALO	0 h. ALO	4 h. BLO
interrompere l'allenamento	1 h. ALO	1 h. ALO	4 h. ALO
avviare il test	1 h. ALO	2 h. ALO	0 h. ALO (giorno successivo)
ALO = dopo l'accendono le luci, BLO = prima che le luci si accendono, STM = memoria a breve termine, LTM = memoria a lungo termine

Tabella 3: Dati statistici prodotti dalla scrittura Analearn.
Dati statistici prodotti dalla scrittura analearn. Il file di output dello script R di bootsstrappingcontenente ilgenotipo, la condizione di apprendimento ( ad esempio , apprendimento, STM o LTM), significa CI ingenuo, media CI addestrato, LI, differenza tra LI del controllo rispetto alla condizione sperimentale (LI dif), il limite inferiore (LL) e il limite superiore (UL) dell'intervallo di confidenza del 95% di LI dif e il valore pche indica la probabilità che non vi sia alcuna differenza significativa.

genotipo	apprendimento	Ci	Ci	LI	LI	Limite inferiore	Limite superiore	valore p
	condizione	ingenuo	ammaestrato		differenza	(intervallo di conficenza del 95%)	(intervallo di conficenza del 95%)
controllo	Stm	0.467	0.116	0.752	Na	Na	Na	Na
Dhap-at-RNAi	Stm	0.699	0.257	0.633	0.119	-0.03	0.265	0.116
controllo	LTM	0.59	0.384	0.348	Na	Na	Na	Na
Dhap-at-RNAi	LTM	0.697	0.65	0.068	0.28	0.103	0.446	0.003

File supplementare S1: Piano edilizio di una camera di corteggiamento. Il file può essere aperto con qualsiasi applicazione che consenta estensioni stp (file CAD). Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare S2: esempio di file di input per lo script Analearn. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare S3: Lo script Analearn.R. Il file può essere aperto con R-studio. Clicca qui per scaricare questo file.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
P{KK101437}VIE-260B	VDRC	101437	Dhat-at-RNAi in 60100 background
P{KK108109}VIE-260B	-	-	Control-RNAi in 60100 background (gift from K. Keleman)
w+, UAS-dcr2/yhh;;elav-Gal4 (III)	-	-	panneuronal driver line
Containers for plant tissue culture	VWR	960177	175 mL plastic vials
Folded filters	Whatman	10311643	Filter paper to enlarge area flies can pupate on
Flat-bottom blocks (96-wells)	Qiagen	19579	Used for housing blocks
MicroAmp Clear Adhesive Film	Applied Biosystems	4306311	PCR adhesive film as lid on flat-bottom blocks
Razor blade	-	-	Any sharp will do
Needle	-	-	0.8 mm diameter
Aspirator	-	-	Cut a 1mL pipet tip with scissors in order to have two pieces. The narrow tip of the pipettip is placed as fly entrance in a ~80 cm flexible hose. To prevent a fly from getting in the hose, a normal piece of cotton or small mesh gaze is placed in between the tip and the hose. The other half of the pipettip can be used as mouth piece at the end of the hose.
Courtship chambers	-	-	file S1 can be opened with indicated CAD software
Camcorder	Sony	-	camera specification: >4M pixels, full HD.
For manual quantification, any simple video recording device has the potential to produce a video of sufficient quality to observe courtship behavior accurately. For automated quantification, there will likely be different requirements depending on the software to be used, and users should investigate this thoroughly if automated quantification is desired.
Name	Company	Catalog Number	Comments
power food
Agar	Sigma	A7002
Yeast	Bruggeman	-
Yeast extract	MP biomedicals	0210330391
Peptone	Sigma	P6838
Sucrose	Sigma	S9378
Glucose	Sigma	G7021
MgSO4	Sigma	M2643
CaCl2	Merck	1023780500
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	-
Yeast paste	-		yeast grains and water mixture in a 1:1 ratio
Name	Company	Catalog Number	Comments
normal food
Agar	MP biomedicals	215017890
Yeast	bruggeman	-
Corn flour	de Molen	-
Sugar	de Molen	-
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	-