Drosophila Courtship Conditioning: En metode til at teste læring og hukommelse i fluer

Overview

Denne video beskriver en klassisk conditioning assay, der tester læring og hukommelse i Drosophila, kaldet frieri conditioning. Analysen er baseret på reduktion af mandlige frieri efter at have oplevet en afvisning af en ikke-modtagelig premated kvinde. Eksempelprotokollen viser en opsætning af den procedure, der kan bruges til at vurdere kort- og langtidshukommelse.

Protocol

Denne protokol er et uddrag fra Koemans et al., Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory, J. Vis. Exp. (2017).

BEMÆRK: I den protokol, der er beskrevet nedenfor, beskrives en replikat af indsamling, træning og test. For at teste reproducerbarheden af resultaterne skal disse trin gentages parallelt, på flere dage og med separate grupper af fluer (tabel 1). Protokollen er baseret på en 10 dages livscyklus fra æg til voksen, hvilket er normalt, når opdræt flyver under konstante forhold på 25 °C, 70% fugtighed og en 12 timers lys / mørk cyklus. Alle aspekter af denne protokol antager, at betingelserne holdes konstante under hele analysen. Tiderne er angivet som timer før lyset tændes (BLO) eller efter lys tændes (ALO) i inkubatoren, da dette nemt kan indstilles afhængigt af forskerens foretrukne tidspunkt på dagen. Brug kun CO_2-gas til den første samling af naive hanfluer og til indsamling af premated hunner. Denne protokol for konditionering af frieri består af følgende trin:

1. Etablering af præmerede kvindelige indsamlingskulturer
2. Etablering af kulturer til indsamling af mandlige forsøgspersoner
3. Forberedelse af boligblokke
4. Etablering af parringsglas til fremstilling af standardiserede forarbejdede hunner
5. Indsamling af mandlige forsøgspersoner
6. Uddannelse
7. Test
8. Analyse og statistik af videodata

1. Etablering af premated kvindelige samling kulturer

1. Gør powerfood klar. Kog 0,8% (w/v) agar, 8% (w/v) gær, 2% (w/v) gærekstrakt, 2% (w/v) pepton, 3% (w/v) saccharose, 6% (w/v) glukose, 0,05% (w/v) MgSO₄og 0,05% (w/v) CaCl₂ i vand i 15 min. Opløsningen afkøles til 70 °C, inden der tilsættes 0,05% (w/v) methylparaben (ADVARSEL: giftig) og 0,5% (v/v) propionsyre (ADVARSEL: giftig). Bland godt ved omrøring under afkøling længere til 50 °C for at opnå en homogen opløsning.
2. Før maden størkner ved stuetemperatur, tilsættes ~ 50 mL powerfood til hver 175 mL plast hætteglas. Lad maden køle yderligere af. Luk hætteglasset med et stik.
   BEMÆRK: Powerfood er en specialiseret fødevareblanding formuleret specielt til produktion af et stort antal fluer, formentlig ved at fremkalde æglægning. Powerfood bruges ikke til at producere mandlige fluer, der vil blive brugt til adfærdsanalyse (trin 2), fordi den atypiske kost og potentielle fortrængning kan påvirke udviklingen.
3. På dag -11 (Tabel 1), start 5-20 wildtype kulturer med ca 60-100 fluer (en blanding af mænd og kvinder) i powerfood hætteglas; disse vil blive brugt i trin 4 til at producere standardiserede premated hunner. Tilsæt et filterpapir til hvert hætteglas for at øge det område, hvor larverne kan poppe; dette vil øge antallet af fluer, der kan eclose.
4. Gentag regelmæssigt trin 1.1-1.3 under hele forsøget for at opnå tilstrækkelige nyligt afslørende fluer som input til "etablering af parringsglas til fremstilling af standardiserede præmerede hunner" (trin 4).

2. Etablering af kulturer til indsamling af mandlige forsøgspersoner

1. Forbered normal mad, lavet med 0,5% (w/v) agar, 2,75% (w/v) gær, 5,2% (w/v) majsmel, 11% (w/v) sukker, 0,05% (w/v) methylparaben og 0,5% (v/v) propionsyre i vand, som beskrevet i trin 1.1 og 1.2. Luk 175 mL plastflasker med et flueglasstik.
2. På dag -10 (Tabel 1) placeres ca. 10-20 hanner med ca. 30-75 jomfruhunner (Materiale/Udstyrsbord) i hvert 175 mL hætteglas, der indeholder normal mad. Tilføj et filterpapir for at øge overfladearealet til hvalp og for at maksimere produktiviteten.
3. Der fastsættes tre til seks 175 mL hætteglas pr. genotype for at opnå det krævede antal forsøgspersoner.
   BEMÆRK: Der kan være behov for flere hætteglas afhængigt af produktiviteten af den ønskede genotype.

3. Forberedelse af boligblokke (figur 2A)

1. Smelt ca. 50 mL powerfood pr. boligblok i en mikrobølgeovn, eller forbered den frisk.
2. Der tilsættes 500 μL powerfood til hver brønd i en 96-brønds, fladbundet blok ved hjælp af en flerdispenserpipette.
3. Lad maden størkne ved stuetemperatur.
4. Dæk blokkene med PCR klæbefilm og brug en nål til at lave mindst 4 huller pr. brønd for at give frisk luft til fluerne.
5. For at kunne åbne hver brønd skal du bruge et barberblad til at skære klæbefilmen på langs mellem hver række. Lad filmen være intakt i den ene ende af blokken.
6. Blokkene kan opbevares ved 4 °C i op til 2 dage.
   BEMÆRK: Lad blokkene ekvilibrere til stuetemperatur før brug.

4. Etablering af parringsglas til produktion af standardiserede forarbejdede kvinder

1. På dag -1, fjerne og kassere alle voksne wildtype fluer fra premated kvindelige indsamling kulturer på 2-5 timer BLO.
2. Indsamle fluer ved hjælp af aspirator (Figur 2B) fra disse hætteglas i 2- til 3-timers intervaller(f.eks på 30 min, 2,5 h, og 5 h ALO) og læg dem i en ny powerfood hætteglas suppleret med en lille mængde gær pasta og filterpapir.
3. For at undgå trængsel og for at fremme en optimal parringsatmosfære må du ikke overføre mere end 150-200 fluer til hvert nyt hætteglas. Sørg for parring af alle kvinder ved at give mindst 25% mænd. Sørg for, at der er tilstrækkelige hunner til stede i parringsglassene til at rumme eksperimentets størrelse.
   BEMÆRK: Da dette er et afgørende skridt i protokollen, skal du sørge for, at kun friskeksploserede fluer og ingen gamle fluer, larver eller pupper overføres til det nye parringsglas.
4. Inkuber disse "parringsglas" i fire dage for at give tilstrækkelig tid til, at alle kvinder har parret sig.

5. Indsamling af mandlige forsøgspersoner

1. På dag 1(Tabel 1)ved 2-3 timers BLO skal du bruge CO₂ til at fjerne alle voksne fluer fra de mandlige samlingsglas (trin 2), men lad flere fluer etabere i løbet af de næste par timer.
2. I løbet af de næste 5-6 timer skal du fjerne nyligt ekskloserede fluer hvert 20.-30. minut ved hjælp af CO₂ og sætte hver mand i en individuel brønd i boligblokken (trin 3) ved hjælp af aspiratoren (Figur 2B).
3. Forsegl brønden igen med den klæbende PCR-film.
   BEMÆRK: Det er et afgørende skridt i protokollen. Hannerne skal opsamles hyppigt. Indsamlede mænd skal isoleres i boligblokken tæt på tidspunktet for eklosion, når de demonstrerer bleg pigmentering og tilstedeværelsen af meconium i den gennemskinnelige mave.
   BEMÆRK: Skånsom brug af aspiratoren tillader overførsel af fluer; Uhensigtsmæssig brug vil dog understrege fluerne og forårsage varians i analysen (se diskussionen).
4. Tilstræbe at indsamle op til 48 hanner per genotype. Dette giver et lille overskud til det maksimale antal mænd, der er nødvendige for analysen af både naive og uddannede forhold, hvilket giver mulighed for et vist tab under senere overførselstrin.

6. Træning

1. Fjern fluerne fra parringsglasset (trin 4.2) ved hjælp af CO₂ og adskil de premated hunner fra hannerne.
2. Brug aspiratoren til at tilføje en enkelt bedøvet, premated kvinde til hver brønd i en række af en ny boligblok.
3. Ved hjælp af aspiratoren og uden anæstesi overføres en individuel naiv mand fra boligblokken, der er oprettet i trin 5.2, til brønden, der indeholder en premated kvinde. Når hanen er placeret i brønden, forsegles straks igen med klæbefilmen; lad ikke hanen undslippe.
   BEMÆRK: Overfør mandlige fluer fra aspiratoren til boligblokken ved at drage fordel af deres naturlige "negative geotaxis" adfærd.
4. Gentag trin 6.2-6.3, indtil der er etableret nok mandlige-kvindelige par. Ideelt set etablere 24 par, to fulde rækker af en boligblok, pr. Genotype. Lad de resterende naive hanner være i den oprindelige boligblok, der blev oprettet i trin 5.2.
5. Lad par mellem mænd og kvinder være uforstyrrede i løbet af uddannelsesperioden (tabel 2, figur 1B).
   BEMÆRK: I løbet af denne tid vil hanen retten og blive afvist af den premated kvinde. For læring og STM er træningsperioden 1 time, og for LTM er træningsperioden 7-9 timer.
6. Afslutte uddannelsen (tabel 2, figur 1B) ved at bruge en aspirator til forsigtigt at adskille hannen fra den formatiske kvinde; brug ikke anæstesi. Placer den separerede mand i en ny boligblok.
7. Brug aspiratoren til at overføre alle naive hanner forsigtigt og uden bedøvelse fra boligblokken, der er oprettet i trin 5.2, til en ny boligblok.
   BEMÆRK: Dette trin er valgfrit for STM og læring, men det er meget vigtigt for LTM, fordi fluerne har til huse i yderligere 24 timer for at teste LTM.
8. For STM og LTM skal hannerne hvile i henholdsvis 1 time og ~24 timer (tabel 2, figur 1B) før testning (trin 7).
9. For læring skal du straks teste de uddannede og naive mænd (trin 7).

7. Test

1. Saml fluer fra parringsglas (trin 4.2) ved hjælp af CO₂ og adskil de premated hunner fra hannerne.
2. Lad hunnerne komme sig over anæstesi i mindst 1 time i et hætteglas, der indeholder normal mad.
3. Monter videooptagerne på forhånd (Figur 2C) for at have alt udstyr klar, før testen starter.
4. Start testen i henhold til de forskellige tidslinjer for læring, STM og LTM (Tabel 2, Figur 1B). Udfør test umiddelbart efter træning til læring, 1 time efter træning for STM og 24 timer efter træning for LTM.
5. Brug aspiratoren til forsigtigt at overføre en enkelt mand fra hvilehusblokken eller fra uddannelseshusblokken, hvis læringen testes (trin 6.7, uddannet; trin 6.8, naiv) til halvdelen af en frieriarena med skillevæggen lukket (Figur 2D; se Fil S1 for en byggeplan).
   BEMÆRK: Brugen af den naturlige "negative geotaxis" adfærd bør være tilstrækkelig til at overføre de mandlige fluer fra aspiratoren til frieriarenaen.
6. Hurtigt, men forsigtigt flytte indgang hul til den næste arena og gentag trin 7,5, indtil alle 18 arenaer indeholder en mand.
7. Brug aspirator og uden CO₂, tilføje en premated kvinde (indsamlet i trin 7,2) til den anden halvdel af alle 18 arenaer.
8. Placer forsigtigt frierikammeret under kameraet, hvor brøndene åbnes nedad (figur 2C).
9. Fjern skillelinjen af arenaerne for at tillade direkte interaktion mellem mænd og premated kvinder.
10. Begynd straks at optage adfærden i mindst 10 minutter.
    BEMÆRK: Når du bruger en opsætning med to kameraer, kan den parallelle optagelse af to frieriplader udføres inden for overlappende tidsrammer for at maksimere effektiviteten.
11. Tøm frieriarenaerne ved hjælp af en håndholdt støvsuger, og lad frierikammeret ventilere, før det genbruges.
12. Gentag trin 7.4-7.11, indtil afprøvningen af alle genotyper og tilstande(dvs. naive og uddannede) er afsluttet.

8. Analyse af videodata og statistik

1. Beregn frieriindekset (CI), defineret som den procentdel af tiden, som de mandlige domstole i løbet af de første 10 minutter af testperioden, for hver enkelt mandlig flue.
   BEMÆRK: Dette kan gøres manuelt ved at observere stereotype frieri adfærd (Figur 1A) eller ved hjælp af edb-software til automatiseret kvantificering af frieri adfærd.
   BEMÆRK: Det anbefales at analysere 40-60 hanner pr. betingelse i løbet af tre dage for at opnå tilstrækkelig statistisk effekt og bedømme konsistensen af CI-dataene.
2. Beregn læringsindekset (LI), defineret som den procentvise reduktion i den gennemsnitlige CI for uddannede mænd sammenlignet med naive mænd (LI = (CI_naiv – CI_uddannet) / CI_naiv). Vurder LI'en for hver testdag, og sammenlign den med den kumulative LI, der beregnes ud fra alle testdage tilsammen.
3. Opret en separat datafil med to kolonner med "Genotype" og "CI" som overskrifter.
   BEMÆRK: Der er store og små bogstaver i disse overskrifter. Navnet på genotypen for hvert EF-erhvervsgrenen skal bestå af en beskrivelse af genotypen efterfulgt af et understregningstegn og uddannelsestilstanden(f.eks. genotype_N og genotype_LTM osv., hvor N = naiv og LTM = langtidshukommelse; se supplerende fil S2 for eksempel). Denne anmærkning er afgørende, da funktionen analearn vil identificere uddannede og naive fluer baseret på de tegn, der er til stede efter den første understregning i kolonnen "Genotype".
4. Brug analearn R-scriptet (Supplerende fil S3) til at udføre en randomiseringstest for at bedømme den statistiske betydning af forskelle mellem LI-værdierne fra forskellige genotyper.
   1. Kilde scriptet (Supplerende Fil S3) i R, som definerer en funktion kaldet "analearn."
      BEMÆRK: Funktionsdefinitionen er: analearn <- function(nboot = 10.000, naivevel = 'N', refmutation = NA, datname = NA, header = TRUE, seed = NA, writeoutput = TRUE).
   2. Start funktionen ved at indtaste "analearn()" på kommandolinjen R og vælge den datafil, der skal analyseres (produceret i trin 8.3) via pop op-vinduet.
   3. Vælg referencemutationen, som er kontrolgenotypen, ved at indtaste det tilsvarende tal og trykke på enter.
      BEMÆRK: Når du har valgt referencegenotypen, tager det flere sekunder for scriptet at udføre 10.000 bootstrap-replikater.
   4. Overhold outputtabellen (tabel 3), som indeholder genotypen, indlæringstilstanden (dvs.læring, STM eller LTM), middelværdien CI naiv, gennemsnitlig CI-uddannet, LI, forskellen mellem LI for styringen sammenlignet med forsøgstilstanden (LI dif), den nedre grænse (LL) og den øvre grænse (UL) for LI-dif'ens konfidensinterval på 95% og p-værdien,der angiver sandsynligheden for, at der ikke er nogen signifikant forskel.
      BEMÆRK: Analearn gemmer en outputtekstfil i den mappe, hvor datafilen er placeret. Outputtabellen vises dog også i R-Studio-konsollen. Standardnavnet er konstrueret på basis af navnet på den angivne datafil.
   5. Der er flere argumenter i analearn-funktionen, der kan bruges til at ændre standardindstillingerne for funktionen for at justere parametrene for bootstrapping.
      BEMÆRK: "nboot" definerer antallet af bootstrap-replikater og er som standard indstillet til 10.000. Denne værdi kan ændres til et heltal, der er større end nul. Tabel 5 indeholder flere argumenter, der kan bruges til at ændre standardindstillingerne for funktionen. Det anbefales dog ikke at bruge data, der er produceret med et lavt antal bootstrap-replikater.

Representative Results

Figur 1: Fastlæggelse af frieriindekset og eksperimentel oversigt. (A)Billeder, der viser stereotype mandlige frieri adfærd over for en kvindelig flyve. Forskellige stadier af frieri adfærd er vist: orientering (I), følgende (II), vingevibrationer (udvidelse) og trykke (III), slikke (IV), og forsøg på samleje (V). (B) Skematisk oversigt over trænings- og testtider i forhold til inkubatorens lyscyklus, markeret i timer. Træningstider angives med stænger, hvileperioder for STM og LTM angives med en stiplet linje, og teststartpunktet angives som en pil. Bemærk, at testtiden for LTM er dagen efter træningen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Udstyr, der anvendes til Drosophila Courtship Conditioning Assay. (A) Boligblokken er en flad, bundblok med 500 μL powerfood pr. brønd. Den forsegles med en qPCR-klæbefilm med mindst 4 huller pr. brønd, der blev skabt ved hjælp af en sprøjtenål med en diameter på 0,8 mm. Individuelle rækker skæres i længderetningen i strimler ved hjælp af et barberblad for at tillade åbning og lukning. (B) Aspiratoren er nødvendig for den blide overførsel af han- og hunfluer uden brug af anæstesi. Indsaten viser spidsen af aspiratoren, lukket med et stykke bomuld for at holde fluerne inden for spidsen. (C) Opsætning af et to-kamera system til samtidig optagelse af to frieri kamre. (D) Et frieri kammer med 18 arenaer. Glidende indgangshuller bruges til at placere fluerne i arenaerne. De hvide skillevægge kan samtidig åbnes for at indlede interaktion mellem mænd og kvinder. Klik her for at se en større version af dette tal.

Tabel 1: Eksempel på tidslinje til test af LTM over tre replikater på individuelle dage.

	Generel	Indsamle	Tog	Test
dag -11	Start premated kvindelige indsamling kulturer (trin 1,3)
dag -10	Startkulturer til indsamling af mandlige forsøgspersoner (trin 2.2)
dag 1		rep. 1
dag 2		rep. 2
dag 3		rep. 3
dag 4		rep. 4	rep. 1
dag 5			rep. 2	rep. 1
dag 6			rep. 3	rep. 2
dag 7			rep. 4	rep. 3
dag 8				rep. 4
dag 9	Analyse og statistik af videodata (trin 8)
rep = gentag

Tabel 2: Træningsvarighed, træningstider og testtider for læring, STM og LTM

	Læring	Stm	Ltm
Træningstid	1 time.	1 time.	Kl. 20.00.
Hviletid	0 timer.	1 time.	- 24 timer.
starte træning	0 h. ALO	0 h. ALO	4 timer BLO
stoppe træningen	1 h. ALO	1 h. ALO	4. ALO
starte test	1 h. ALO	2. ALO	0 h. ALO (næste dag)
ALO = efter lys tændes, BLO = før lyset tændes, STM = korttidshukommelse, LTM = langtidshukommelse

Tabel 3: Statistiske data fra Analearn-scriptet.
Statistiske data fra analearn scriptet. Outputfilen for bootstrapping R-scriptet, der indeholder genotypen, indlæringstilstanden (dvs.læring, STM eller LTM), betyder CI naiv, gennemsnitlig CI-uddannet, LI, forskel mellem LI af kontrollen sammenlignet med eksperimentel tilstand (LI dif), den nedre grænse (LL) og øvre grænse (UL) for 95% konfidensintervallet for LI dif og p-værdien, der angiver sandsynligheden for, at der ikke er nogen signifikant forskel.

Genotype	Læring	Ci	Ci	Li	Li	Nedre grænse	Øvre grænse	p-værdi
	Betingelse	Naive	Uddannet		Forskel	(95% konficensinterval)	(95% konficensinterval)
Kontrol	Stm	0.467	0.116	0.752	Na	Na	Na	Na
Dhap-at-RNAi	Stm	0.699	0.257	0.633	0.119	-0.03	0.265	0.116
Kontrol	Ltm	0.59	0.384	0.348	Na	Na	Na	Na
Dhap-at-RNAi	Ltm	0.697	0.65	0.068	0.28	0.103	0.446	0.003

Supplerende Fil S1: Byggeplan for et frieri kammer. Filen kan åbnes med alle programmer, der tillader .stp-filtypenavne (CAD-filer). Klik her for at hente denne fil.

Supplerende fil S2: Eksempel på en inputfil til Analearn-scriptet. Klik her for at hente denne fil.

Supplerende fil S3: Den Analearn.r Script. Filen kan åbnes med R-studio. Klik her for at hente denne fil.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
P{KK101437}VIE-260B	VDRC	101437	Dhat-at-RNAi in 60100 background
P{KK108109}VIE-260B	-	-	Control-RNAi in 60100 background (gift from K. Keleman)
w+, UAS-dcr2/yhh;;elav-Gal4 (III)	-	-	panneuronal driver line
Containers for plant tissue culture	VWR	960177	175 mL plastic vials
Folded filters	Whatman	10311643	Filter paper to enlarge area flies can pupate on
Flat-bottom blocks (96-wells)	Qiagen	19579	Used for housing blocks
MicroAmp Clear Adhesive Film	Applied Biosystems	4306311	PCR adhesive film as lid on flat-bottom blocks
Razor blade	-	-	Any sharp will do
Needle	-	-	0.8 mm diameter
Aspirator	-	-	Cut a 1mL pipet tip with scissors in order to have two pieces. The narrow tip of the pipettip is placed as fly entrance in a ~80 cm flexible hose. To prevent a fly from getting in the hose, a normal piece of cotton or small mesh gaze is placed in between the tip and the hose. The other half of the pipettip can be used as mouth piece at the end of the hose.
Courtship chambers	-	-	file S1 can be opened with indicated CAD software
Camcorder	Sony	-	camera specification: >4M pixels, full HD.
For manual quantification, any simple video recording device has the potential to produce a video of sufficient quality to observe courtship behavior accurately. For automated quantification, there will likely be different requirements depending on the software to be used, and users should investigate this thoroughly if automated quantification is desired.
Name	Company	Catalog Number	Comments
power food
Agar	Sigma	A7002
Yeast	Bruggeman	-
Yeast extract	MP biomedicals	0210330391
Peptone	Sigma	P6838
Sucrose	Sigma	S9378
Glucose	Sigma	G7021
MgSO4	Sigma	M2643
CaCl2	Merck	1023780500
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	-
Yeast paste	-		yeast grains and water mixture in a 1:1 ratio
Name	Company	Catalog Number	Comments
normal food
Agar	MP biomedicals	215017890
Yeast	bruggeman	-
Corn flour	de Molen	-
Sugar	de Molen	-
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	-