Drosophila ( Drosophila ) Conditionnement de la cour : une méthode pour tester l’apprentissage et la mémoire chez les mouches

Overview

Cette vidéo décrit un test de conditionnement classique qui teste l’apprentissage et la mémoire à Drosophila, appelé conditionnement de la cour. L’analyse est basée sur la réduction de la cour masculine après avoir subi un rejet par une femelle prématée non réceptive. Le protocole d’exemple montre une configuration de la procédure qui peut être utilisée pour évaluer la mémoire à court et à long terme.

Protocol

Ce protocole est un extrait de Koemans et coll., Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory, J. Vis. Exp. (2017).

REMARQUE: Dans le protocole décrit ci-dessous, une réplique de la collecte, de la formation et des tests est décrite. Afin de tester la reproductibilité des résultats, ces étapes doivent être répétées en parallèle, sur plusieurs jours, et avec des groupes distincts de mouches (tableau 1). Le protocole est basé sur un cycle de vie de 10 jours de l’œuf à l’adulte, ce qui est normal lors de l’élevage des mouches dans des conditions constantes de 25 °C, 70% d’humidité, et un cycle lumière/obscurité de 12 h. Tous les aspects de ce protocole supposent que les conditions sont maintenues constantes tout au long de l’analyse. Les heures sont indiquées comme des heures avant que les lumières s’allument (BLO) ou après que les lumières s’allument (ALO) dans l’incubateur, car ceci peut être commodément réglé selon l’heure préférée du chercheur de la journée. N’utilisez le gaz CO₂ que pour la collecte initiale des mouches mâles naïves et pour la collecte des femelles prématées. Ce protocole pour le conditionnement de la cour est composé des étapes suivantes :

1. Établissement de cultures de collection féminine prématées
2. Établissement de cultures pour la collection de sujets d’essai masculins
3. Préparation de blocs de logement
4. Mise en place de flacons d’accouplement pour la production de femelles prématées normalisées
5. Collection de sujets d’essai masculins
6. formation
7. test
8. Analyse et statistiques de données vidéo

1. Établissement de cultures de collection féminine prématées

1. Préparez des aliments électriques. Faire bouillir 0,8 % (w/v) d’agar, 8% (w/v) levure, 2% (w/v) extrait de levure, 2% (w/v) peptone, 3% (w/v) saccharose, 6% (w/v) glucose, 0,05% (w/v) MgSO₄, et 0,05% (w/v) CaCl_{2 dans} l’eau pendant 15 min. Laisser refroidir la solution à 70 °C avant d’ajouter 0,05 % (w/v) de méthylparabene(ATTENTION : toxique)et 0,5 % (v/v) d’acide propionique(ATTENTION : toxique). Bien mélanger en remuant tout en refroidissant davantage à 50 °C pour obtenir une solution homogène.
2. Avant que les aliments ne se solidifient à température ambiante, ajouter environ 50 mL de powerfood à chaque flacon en plastique de 175 mL. Laisser refroidir davantage les aliments. Fermez le flacon à l’aide d’une prise.
   REMARQUE: Powerfood est un mélange alimentaire spécialisé formulé spécifiquement pour la production d’un grand nombre de mouches, vraisemblablement en induisant la ponte. Powerfood n’est pas utilisé pour produire des mouches mâles qui seront utilisées pour l’analyse du comportement (étape 2) parce que le régime atypique et l’encombrement potentiel pourrait influencer le développement.
3. Le jour -11 (tableau 1), commencer 5-20 cultures de type sauvage avec environ 60-100 mouches (un mélange de mâles et de femelles) dans les flacons powerfood; ceux-ci seront utilisés à l’étape 4 pour produire des femelles prématées normalisées. Ajouter un papier filtre à chaque flacon pour augmenter la zone sur laquelle les larves peuvent se puper; cela augmentera le nombre de mouches qui peuvent s’enfermer.
4. Répétez périodiquement les étapes 1.1-1.3 tout au long de l’expérience pour obtenir suffisamment de mouches nouvellement refermées comme entrée pour « l’établissement de flacons d’accouplement pour la production de femelles prématées normalisées » (étape 4).

2. Établissement de cultures pour la collection de sujets d’essai masculins

1. Préparer des aliments normaux, faits avec 0,5 % (w/v) d’agar, 2,75 % (w/v) levure, 5,2 % (w/v) farine de maïs, 11 % (w/v) sucre, 0,05 % (w/v) méthylparabene et 0,5 % (v/v) acide propionique dans l’eau, tel que décrit dans les étapes 1.1 et 1.2. Fermez les flacons en plastique de 175 mL à l’aide d’un bouchon de flacon volant.
2. Le jour -10 (Tableau 1), placer environ 10-20 mâles avec environ 30-75 femelles vierges (Matériaux / Table d’équipement) dans chaque flacon de 175 mL contenant des aliments normaux. Ajouter un papier filtre pour augmenter la surface de la pupation et maximiser la productivité.
3. Établir trois à six flacons de 175 mL par génotype pour obtenir le nombre requis de mâles soumis à l’essai.
   REMARQUE: Plus de flacons peuvent être nécessaires, selon la productivité du génotype désiré.

3. Préparation des blocs de logement (Figure 2A)

1. Faire fondre environ 50 mL de powerfood par bloc de logement dans un four à micro-ondes, ou le préparer frais.
2. Ajouter 500 μL de powerfood à chaque puits d’un bloc à fond plat de 96 puits à l’aide d’une pipette multidispenser.
3. Laissez les aliments se solidifier à température ambiante.
4. Couvrir les blocs avec un film adhésif PCR et utiliser une aiguille pour faire au moins 4 trous par puits pour fournir de l’air frais aux mouches.
5. Afin de pouvoir ouvrir chaque puits, utilisez une lame de rasoir pour couper le film adhésif dans le sens de la longueur entre chaque rangée. Laissez le film intact à une extrémité du bloc.
6. Les blocs peuvent être stockés à 4 °C jusqu’à 2 jours.
   REMARQUE: Laissez les blocs se rééquilibrer à température ambiante avant de les utiliser.

4. Création de flacons d’accouplement pour la production de femelles prématées normalisées

1. Le jour -1, retirez et jetez toutes les mouches adultes de type sauvage provenant de cultures de collection femelles prématées à 2-5 h BLO.
2. Recueillir les mouches à l’aide de l’aspirateur (figure 2B) à partir de ces flacons dans des intervalles de 2 à 3 heures(par exemple, à 30 min, 2,5 h et 5 h ALO) et les placer dans un nouveau flacon powerfood complété par une petite quantité de pâte de levure et de papier filtre.
3. Pour éviter l’encombrement et promouvoir une atmosphère d’accouplement optimale, ne transférez pas plus de 150 à 200 mouches à chaque nouveau flacon. Assurer l’accouplement de toutes les femelles en fournissant au moins 25% de mâles. Assurez-vous qu’il y a suffisamment de femelles dans les flacons d’accouplement pour tenir compte de la taille de l’expérience.
   REMARQUE: Comme il s’agit d’une étape cruciale du protocole, assurez-vous que seules les mouches fraîchement fermées et aucune vieille mouche, larve ou pupe ne sont transférées sur le nouveau flacon d’accouplement.
4. Incuber ces « flacons d’accouplement » pendant quatre jours pour laisser suffisamment de temps à toutes les femelles pour qu’elles s’accouplent.

5. Collection de sujets d’essai masculins

1. Le jour 1 (Tableau 1) à 2-3 h BLO, utiliser le CO₂ pour enlever toutes les mouches adultes des flacons de collecte masculine (étape 2), mais laisser plus de mouches s’enfermer au cours des prochaines heures.
2. Au cours des 5-6 prochaines heures, retirez les mouches nouvellement fermées toutes les 20-30 min à l’aide de CO₂ et mettez chaque mâle dans un puits individuel du bloc de logement (étape 3) à l’aide de l’aspirateur (figure 2B).
3. Resceller le puits avec le film PCR adhésif.
   REMARQUE: Il s’agit d’une étape cruciale du protocole. Les mâles doivent être recueillis fréquemment. Les mâles recueillis doivent être isolés dans le bloc de logement près du moment de l’éclosion, quand ils démontrent la pigmentation pâle et la présence du méconium dans l’abdomen translucide.
   REMARQUE: L’utilisation douce de l’aspirateur permet le transfert des mouches; toutefois, une utilisation inappropriée mettra l’accent sur les mouches, ce qui causera une variance dans l’analyse (voir la discussion).
4. Visez à recueillir jusqu’à 48 mâles par génotype. Cela fournit un petit excès au nombre maximal d’hommes nécessaires à l’analyse des conditions naïves et entraînées, ce qui permet une certaine perte lors des étapes de transfert ultérieures.

6. Formation

1. Retirer les mouches du flacon d’accouplement (étape 4.2) à_{l’aide du} CO 2 et séparer les femelles prématées des mâles.
2. À l’aide de l’aspirateur, ajouter une seule femelle anesthésiée et prématée à chaque puits dans une rangée d’un nouveau bloc d’habitation.
3. À l’aide de l’aspirateur et sans anesthésie, transférez un mâle naïf individuel du bloc de logement mis en place à l’étape 5.2 au puits contenant une femelle prématée. Après que le mâle est placé dans le puits, re-sceller immédiatement avec le film adhésif; ne permettent pas au mâle de s’échapper.
   REMARQUE: Transférez les mouches mâles de l’aspirateur au bloc de logement en profitant de leur comportement naturel de « géotaxis négatif ».
4. Répétez les étapes 6.2-6.3 jusqu’à ce que suffisamment de paires hommes-femmes soient établies. Idéalement, établissez 24 paires, deux rangées complètes d’un bloc de logement, par génotype. Laissez les mâles naïfs restants dans le bloc d’habitation d’origine mis en place à l’étape 5.2.
5. Laissez les couples hommes-femmes intacts pendant la période d’entraînement (tableau 2, figure 1B).
   REMARQUE: Pendant ce temps, l’homme courtisera et sera rejeté par la femelle prématée. Pour l’apprentissage et la STM, la période de formation est de 1 h et pour le ML, la période de formation est de 7 à 9 h.
6. Mettre fin à l’entraînement (tableau 2, figure 1B) à l’aide d’un aspirateur pour séparer doucement le mâle de la femelle prématée; n’utilisez pas d’anesthésie. Placez le mâle séparé dans un nouveau bloc d’habitation.
7. Utilisez l’aspirateur pour transférer tous les mâles naïfs doucement et sans anesthésie du bloc de logement mis en place à l’étape 5.2 à un nouveau bloc de logement.
   REMARQUE: Cette étape est facultative pour la STM et l’apprentissage, mais elle est très importante pour LTM parce que les mouches sont logées pour 24 h supplémentaires pour tester LTM.
8. Pour la STM et la LTM, permettre aux mâles de se reposer pendant 1 h et ~24 h, respectivement (tableau 2, figure 1B) avant les essais (étape 7).
9. Pour l’apprentissage, testez immédiatement les mâles formés et naïfs (étape 7).

7. Essais

1. Recueillir les mouches des flacons d’accouplement (étape 4.2) à_{l’aide du} CO 2 et séparer les femelles prématées des mâles.
2. Laissez les femelles se remettre de l’anesthésie pendant au moins 1 h dans un flacon contenant des aliments normaux.
3. Montez les enregistreurs vidéo à l’avance (figure 2C), afin d’avoir tout l’équipement prêt avant le début des essais.
4. Commencez les tests selon les différents calendriers d’apprentissage, STM et LTM (tableau 2, figure 1B). Effectuez des tests immédiatement après l’entraînement pour l’apprentissage, 1 h après l’entraînement à la STM et 24 h après l’entraînement pour le LTM.
5. À l’aide de l’aspirateur, transférez doucement un mâle individuel du bloc de logement au repos ou du bloc de logement d’entraînement si l’apprentissage est mis à l’essai (étape 6.7, formée; étape 6.8, naïve) à la moitié d’une arène de cour avec le diviseur fermé(figure 2D; voir dossier S1 pour un plan de construction).
   REMARQUE: L’utilisation du comportement naturel de « géotaxis négatifs » devrait être suffisante pour transférer les mouches mâles de l’aspirateur à l’arène de cour.
6. Déplacez rapidement mais doucement le trou d’entrée vers l’arène suivante et répétez l’étape 7.5 jusqu’à ce que les 18 arènes contiennent un mâle.
7. À l’aide de l’aspirateur et sans CO_2,ajouter une femelle prématée (recueillie à l’étape 7.2) à l’autre moitié des 18 arènes.
8. Placez soigneusement la chambre de cour sous la caméra, avec l’ouverture des puits orientés vers le bas (Figure 2C).
9. Retirez le séparateur des arènes pour permettre une interaction directe entre les mâles et les femelles prématées.
10. Commencez immédiatement à enregistrer le comportement pendant au moins 10 min.
    REMARQUE: Lors de l’utilisation d’une configuration à deux caméras, l’enregistrement parallèle de deux plaques de cour peut être fait dans des délais qui se chevauchent pour maximiser l’efficacité.
11. Videz les arènes de la cour à l’aide d’un aspirateur tenu à la main et laissez la chambre de la cour s’aérer avant d’être réutilisée.
12. Répétez l’étape 7.4-7.11 jusqu’à ce que les tests de tous les génotypes et conditions(c.-à-d. naïfs et formés) soient terminés.

8. Analyse et statistiques des données vidéo

1. Calculer l’indice de cour (IC), défini comme le pourcentage de temps que les tribunaux masculins au cours des 10 premières minutes de la période d’essai, pour chaque vol masculin individuel.
   REMARQUE: Cela peut être fait manuellement en observant le comportement stéréotypé de cour (figure 1A) ou en utilisant le logiciel pour la quantification automatisée du comportement de cour.
   REMARQUE: Il est recommandé d’analyser 40 à 60 hommes par condition sur une période de trois jours afin d’atteindre une puissance statistique suffisante et de juger de la cohérence des données de l’IC.
2. Calculer l’indice d’apprentissage (IA), défini comme la réduction en pourcentage de l’IC moyenne des hommes formés par rapport aux hommes naïfs (LI = (CI_naïf – CI_formé) / CI_naïf). Évaluez l’IL pour chaque jour de test et comparez-le à l’A LI cumulatif calculé à partir de tous les jours d’essai combinés.
3. Faites un fichier de données d’onglet à deux colonnes distinct avec « Génotype » et « CI » comme en-têtes.
   REMARQUE: Ces rubriques sont sensibles aux cas. Le nom du génotype pour chaque IC doit consister en une description du génotype suivie d’un soulignement et de l’état d’entraînement(p. ex., genotype_N et genotype_LTM, etc., où N = naïf et LTM = mémoire à long terme; voir dossier supplémentaire S2 par exemple). Cette annotation est essentielle, car la fonction analearn identifiera les mouches entraînées et naïves basées sur les caractères présents après le premier soulignement dans la colonne « Génotype ».
4. Utilisez le script Analearn R (Fichier supplémentaire S3) pour effectuer un test de randomisation pour juger de la signification statistique des différences entre les valeurs li de différents génotypes.
   1. Source du script (Fichier supplémentaire S3) en R, qui définit une fonction appelée « analearn ».
      REMARQUE: La définition de fonction est : analearn <- fonction (nboot = 10.000, naïveté = 'N', refmutation = NA, datname = NA, en-tête = VRAI, graine = NA, writeoutput = TRUE).
   2. Démarrez la fonction en entrant « analearn() » dans la ligne de commande R et en sélectionnant le fichier de données à analyser (produit à l’étape 8.3) via la fenêtre contexturée.
   3. Choisissez la mutation de référence, qui est le génotype de contrôle, en entrant le nombre correspondant et en appuyant sur entrer.
      REMARQUE: Après avoir sélectionné le génotype de référence, le script prend plusieurs secondes pour effectuer 10.000 répliques bootstrap.
   4. Observez le tableau de sortie (tableau 3), qui contient le génotype,l’état d’apprentissage (c.-à-d. l’apprentissage,la STM ou le LTM), la ci moyenne naïve, moyenne ci formée, LI, la différence entre l’ID du contrôle par rapport à l’état expérimental (LI dif), la limite inférieure (LL) et la limite supérieure (UL) de l’intervalle de confiance de 95 % du dif LI, et la valeur pindiquant la probabilité qu’il n’y ait pas de différence significative.
      REMARQUE : analearn stockera un fichier texte de sortie dans l’annuaire où se trouve le fichier de données. Toutefois, la table de sortie apparaît également dans la console R-Studio. Le nom par défaut est construit en fonction du nom du fichier de données fourni.
   5. Il y a plusieurs arguments dans la fonction analearn qui peuvent être utilisés pour modifier les paramètres par défaut de la fonction pour ajuster les paramètres du bootstrapping.
      REMARQUE: « nboot » définit le nombre de répliques bootstrap et est défini à 10.000 par défaut. Cette valeur peut être changée en n’importe quel nombre d’entiers supérieur à zéro. Le tableau 5 enrôle plusieurs arguments qui peuvent être utilisés pour modifier les paramètres par défaut de la fonction. Toutefois, il n’est pas recommandé d’utiliser des données produites avec un faible nombre de répliques bootstrap.

Representative Results

Figure 1 : Détermination de l’indice de cour et vue d’ensemble expérimentale. (A) Images montrant un comportement de cour masculine stéréotypée envers une mouche femelle. Différentes étapes du comportement de la cour sont indiquées : orientation (I), suivi (II), vibration de l’aile (extension) et taraudage (III), léchage (IV) et tentative de copulation (V). (B) Aperçu schématique des temps d’entraînement et d’essai par rapport au cycle lumineux de l’incubateur, marqué en heures. Les temps d’entraînement sont indiqués avec les barres, les périodes de repos pour la STM et le LTM sont indiquées avec une ligne pointillée, et le point de départ des essais est indiqué comme une flèche. Notez que le temps d’essai pour LTM est le lendemain de l’entraînement. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Équipement utilisé pour l’analyse de conditionnement de la cour de Drosophila. (A) Le bloc de logement est un bloc plat et inférieur avec 500 μL de powerfood par puits. Il est scellé avec un film adhésif qPCR avec au moins 4 trous par puits qui ont été créés à l’aide d’une aiguille de seringue d’un diamètre de 0,8 mm. Les rangées individuelles sont coupées dans le sens de la longueur en lanières à l’aide d’une lame de rasoir pour permettre l’ouverture et la fermeture. (B) L’aspirateur est nécessaire pour le transfert doux des mouches mâles et femelles sans l’utilisation de l’anesthésie. L’encart montre la pointe de l’aspirateur, fermée avec un morceau de coton pour garder les mouches dans la pointe. (C) Mise en place d’un système à deux caméras pour l’enregistrement simultané de deux chambres de cour. (D) Une chambre de cour avec 18 arènes. Les trous d’entrée coulissants sont utilisés pour placer les mouches dans les arènes. Les séparateurs blancs peuvent être ouverts simultanément pour initier l’interaction entre les mâles et les femelles. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Tableau 1 : Chronologie par exemple pour tester la LTM sur trois répliques les jours individuels.

	Généralités	recueillir	train	test
jour -11	Démarrer les cultures de collection féminine prématées (étape 1.3)
jour -10	Démarrer des cultures pour la collection de sujets d’essai masculins (étape 2.2)
jour 1		rép. 1
jour 2		rép. 2
jour 3		rép. 3
jour 4		rép. 4	rép. 1
jour 5			rép. 2	rép. 1
jour 6			rép. 3	rép. 2
jour 7			rép. 4	rép. 3
jour 8				rép. 4
jour 9	Analyse des données vidéo et statistiques (étape 8)
rep = répéter

Tableau 2 : Durée de la formation, temps de formation et temps d’essai pour l’apprentissage, STM et LTM

	apprentissage	Stm	LTM (en)
Temps de formation	1 h.	1 h.	8 h.
Temps de repos	0 h.	1 h.	~ 24 h.
commencer la formation	0 h. ALO	0 h. ALO	4 h. BLO
arrêter la formation	1 h. ALO	1 h. ALO	4 h. ALO
commencer le test	1 h. ALO	2 h. ALO	0 h. ALO (le lendemain)
ALO = après l’allumement des lumières, BLO = avant que les lumières s’allument, STM = mémoire à court terme, LTM = mémoire à long terme

Tableau 3 : Données statistiques produites à partir du script Analearn.
Données statistiques produites à partir du script analearn. Le fichier de sortie du script R bootstrapping contenant le génotype,l’état d’apprentissage (c.-à-d.apprentissage, STM, ou LTM), signifie CI naïf, moyenne CI formé, LI, différence entre LI du contrôle par rapport à l’état expérimental (LI dif), la limite inférieure (LL) et la limite supérieure (UL) de l’intervalle de confiance de 95% de LI dif, et la p-valeurindiquant la probabilité qu’il n’y ait pas de différence significative.

génotype	apprentissage	Ci	Ci	Li	Li	Limite inférieure	Limite supérieure	p-valeur
	condition	naïf	dressé		différence	(intervalle de conficence de 95 % )	(intervalle de conficence de 95 % )
contrôle	Stm	0.467	0.116	0.752	Na	Na	Na	Na
Dhap-at-RNAi	Stm	0.699	0.257	0.633	0.119	-0.03	0.265	0.116
contrôle	Mt	0.59	0.384	0.348	Na	Na	Na	Na
Dhap-at-RNAi	Mt	0.697	0.65	0.068	0.28	0.103	0.446	0.003

Dossier supplémentaire S1 : Plan de construction d’une chambre de cour. Le fichier peut être ouvert avec n’importe quelle application qui permet des extensions .stp (cad-files). S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire S2: Exemple d’un fichier d’entrée pour le script Analearn. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire S3: Le script Analearn.R. Le fichier peut être ouvert avec R-studio. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
P{KK101437}VIE-260B	VDRC	101437	Dhat-at-RNAi in 60100 background
P{KK108109}VIE-260B	-	-	Control-RNAi in 60100 background (gift from K. Keleman)
w+, UAS-dcr2/yhh;;elav-Gal4 (III)	-	-	panneuronal driver line
Containers for plant tissue culture	VWR	960177	175 mL plastic vials
Folded filters	Whatman	10311643	Filter paper to enlarge area flies can pupate on
Flat-bottom blocks (96-wells)	Qiagen	19579	Used for housing blocks
MicroAmp Clear Adhesive Film	Applied Biosystems	4306311	PCR adhesive film as lid on flat-bottom blocks
Razor blade	-	-	Any sharp will do
Needle	-	-	0.8 mm diameter
Aspirator	-	-	Cut a 1mL pipet tip with scissors in order to have two pieces. The narrow tip of the pipettip is placed as fly entrance in a ~80 cm flexible hose. To prevent a fly from getting in the hose, a normal piece of cotton or small mesh gaze is placed in between the tip and the hose. The other half of the pipettip can be used as mouth piece at the end of the hose.
Courtship chambers	-	-	file S1 can be opened with indicated CAD software
Camcorder	Sony	-	camera specification: >4M pixels, full HD.
For manual quantification, any simple video recording device has the potential to produce a video of sufficient quality to observe courtship behavior accurately. For automated quantification, there will likely be different requirements depending on the software to be used, and users should investigate this thoroughly if automated quantification is desired.
Name	Company	Catalog Number	Comments
power food
Agar	Sigma	A7002
Yeast	Bruggeman	-
Yeast extract	MP biomedicals	0210330391
Peptone	Sigma	P6838
Sucrose	Sigma	S9378
Glucose	Sigma	G7021
MgSO4	Sigma	M2643
CaCl2	Merck	1023780500
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	-
Yeast paste	-		yeast grains and water mixture in a 1:1 ratio
Name	Company	Catalog Number	Comments
normal food
Agar	MP biomedicals	215017890
Yeast	bruggeman	-
Corn flour	de Molen	-
Sugar	de Molen	-
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	-