Drosophila Courtship Conditioning: Eine Methode, um Lernen und Gedächtnis in Fliegen zu testen

Overview

Dieses Video beschreibt einen klassischen Konditionierungstest, der das Lernen und Gedächtnis in Drosophilatestet, genannt Balzkonditionierung. Der Test basiert auf der Verringerung der männlichen Balz, nachdem er eine Ablehnung durch eine nicht-empfängliche prämated weibliche erlebt hat. Das Beispielprotokoll zeigt eine Einrichtung für die Prozedur, die zur Beurteilung des Kurz- und Langzeitgedächtnisses verwendet werden kann.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Koemans et al., Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory, J. Vis. Exp. (2017).

HINWEIS: Im unten beschriebenen Protokoll wird eine Replikation von Sammlung, Schulung und Tests beschrieben. Um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu testen, sollten diese Schritte parallel, an mehreren Tagen und mit separaten Fliegengruppen wiederholt werden (Tabelle 1). Das Protokoll basiert auf einem 10-Tage-Lebenszyklus vom Ei bis zum Erwachsenen, was normal ist, wenn die Aufzucht unter konstanten Bedingungen von 25 °C, 70% Luftfeuchtigkeit und einem 12 h Hellen/Dunkel-Zyklus ist. Alle Aspekte dieses Protokolls gehen davon aus, dass die Bedingungen während des gesamten Assays konstant gehalten werden. Die Zeiten werden als Stunden vor dem Einschalten der Lichter (BLO) oder nach dem Einschalten der Lichter (ALO) im Inkubator angezeigt, da dies je nach der bevorzugten Tageszeit des Forschers bequem eingestellt werden kann. Verwenden Sie_CO2-Gas nur für die erstmalige Sammlung naiver männlicher Fliegen und für die Sammlung von prämated Weibchen. Dieses Protokoll zur Konditionierung der Höflichkeit besteht aus den folgenden Schritten:

1. Etablierung von prämated weiblichen Sammlungskulturen
2. Etablierung von Kulturen für die Sammlung männlicher Probanden
3. Vorbereitung von Wohnblöcken
4. Herstellung von Paarungsfläschchen für die Herstellung standardisierter Prämatierte
5. Sammlung männlicher Probanden
6. Ausbildung
7. Testen
8. Videodatenanalyse und -statistik

1. Etablierung von prämated Female Collection Cultures

1. Bereiten Sie Powerfood vor. Kochen Sie 0,8% (w/v) Agar, 8% (w/v) Hefe, 2% (w/v) Hefeextrakt, 2% (w/v) Pepton, 3% (w/v) Saccharose, 6% (w/v) Glukose, 0,05% (w/v) MgSO₄und 0,05% (w/v) CaCl₂ in Wasser für 15 min. Lassen Sie die Lösung auf 70 °C abkühlen, bevor Sie 0,05% (w/v) Methylparaben (VORSICHT: giftig) und 0,5% (v/v) Propionsäure (VORSICHT: giftig)hinzufügen. Gut mischen, indem sie beim Abkühlen weiter auf 50 °C abkühlen, um eine homogene Lösung zu erhalten.
2. Bevor das Essen bei Raumtemperatur erstarrt, fügen Sie jeder 175 ml Kunststoff-Durchstechflasche 50 ml Powerfood hinzu. Lassen Sie das Essen weiter abkühlen. Schließen Sie die Durchstechflasche mit einem Stecker.
   HINWEIS: Powerfood ist eine spezielle Lebensmittelmischung, die speziell für die Herstellung einer großen Anzahl von Fliegen entwickelt wurde, vermutlich durch Induktion der Eiablage. Powerfood wird nicht verwendet, um männliche Fliegen zu produzieren, die für die Verhaltensanalyse verwendet werden (Schritt 2), weil die atypische Ernährung und potenzielle Smenge die Entwicklung beeinflussen könnten.
3. Am Tag -11 (Tabelle 1), beginnen 5-20 Wildtypkulturen mit ca. 60-100 Fliegen (eine Mischung aus Männchen und Weibchen) in Powerfood-Fläschchen; diese werden in Schritt 4 zur Herstellung standardisierter vorgegateten Weibchen verwendet. Fügen Sie jeder Durchstechflasche ein Filterpapier hinzu, um die Fläche zu vergrößern, auf der sich die Larven verpupieren können; dies wird die Anzahl der Fliegen erhöhen, die sich schließen können.
4. Wiederholen Sie während des gesamten Experiments regelmäßig die Schritte 1.1-1.3, um genügend neu eclosingierende Fliegen als Input für die "Einrichtung von Paarungsfläschchen für die Herstellung standardisierter prämatisierter Weibchen" zu erhalten (Schritt 4).

2. Etablierung von Kulturen für die Sammlung männlicher Probanden

1. Bereiten Sie normale Lebensmittel vor, die mit 0,5 % (w/v) Agar, 2,75 % (w/v) Hefe, 5,2 % (w/v) Maismehl, 11 % (w/v) Zucker, 0,05 % (w/v) Methylparaben und 0,5 % (v/v) Propionsäure in Wasser hergestellt werden, wie in den Schritten 1.1 und 1.2 beschrieben. Schließen Sie die 175-ml-Kunststoff-Fläschchen mit einem Fliegen-Fläschchen-Stecker.
2. An Tag -10 (Tabelle 1), platzen etwa 10-20 Männchen mit ca. 30-75 Jungfrauenweibchen (Material/Ausrüstungstabelle) in jeder 175 ml Durchstechflasche mit normaler Nahrung. Fügen Sie ein Filterpapier hinzu, um die Oberfläche für die Veruppierung zu erhöhen und die Produktivität zu maximieren.
3. Stellen Sie drei bis sechs 175 ml Durchstechflaschen pro Genotyp fest, um die erforderliche Anzahl von Probandenmännchen zu erhalten.
   HINWEIS: Je nach Produktivität des gewünschten Genotyps können weitere Fläschchen benötigt werden.

3. Vorbereitung von Wohnblöcken (Abbildung 2A)

1. Etwa 50 ml Powerfood pro Gehäuseblock in einer Mikrowelle schmelzen oder frisch zubereiten.
2. Fügen Sie mit einer Multidispenser-Pipette 500 l Powerfood in jeden Brunnen eines 96-Well-Flachbodenblocks ein.
3. Lassen Sie das Essen bei Raumtemperatur erstarren.
4. Bedecken Sie die Blöcke mit PCR-Klebefolie und verwenden Sie eine Nadel, um mindestens 4 Löcher pro Brunnen zu machen, um den Fliegen frische Luft zu liefern.
5. Um jeden Brunnen öffnen zu können, verwenden Sie eine Rasierklinge, um den Klebefilm längs zwischen jede Reihe zu schneiden. Lassen Sie den Film intakt an einem Ende des Blocks.
6. Die Blöcke können bis zu 2 Tage bei 4 °C gelagert werden.
   HINWEIS: Lassen Sie die Blöcke vor der Verwendung wieder auf Raumtemperatur aussetzen.

4. Einrichtung von Paarungsfläschchen für die Herstellung von standardisierten prämated Weibchen

1. Entfernen und entsorgen Sie am Tag -1 alle erwachsenen Wildtypfliegen aus prämated weiblichen Sammlungskulturen bei 2-5 h BLO.
2. Fliegen mit dem Aspirator (Abbildung 2B) von diesen Durchstechflaschen in 2- bis 3-h-Intervallen(z.B. bei 30 min, 2,5 h und 5 h ALO) zu sammeln und in eine neue Powerfood-Durchstechflasche zu legen, die mit einer kleinen Menge Hefepaste und Filterpapier ergänzt wird.
3. Um Gedränge zu vermeiden und eine optimale Paarungsatmosphäre zu fördern, übertragen Sie nicht mehr als 150-200 Fliegen auf jede neue Durchstechflasche. Sorgen Sie für die Paarung aller Weibchen, indem Sie mindestens 25% Männliche zur Verfügung stellen. Stellen Sie sicher, dass genügend Weibchen in den Paarungsfläschchen vorhanden sind, um die Größe des Experiments zu berücksichtigen.
   HINWEIS: Da dies ein entscheidender Schritt im Protokoll ist, stellen Sie sicher, dass nur frisch geschlossene Fliegen und keine alten Fliegen, Larven oder Pupae auf die neue Paarungsflasche übertragen werden.
4. Inkubieren Sie diese "Paarungsfläschchen" für vier Tage, um genügend Zeit für alle Weibchen zu ermöglichen, sich zu paaren.

5. Sammlung männlicher Probanden

1. Verwenden Sie am Tag 1 (Tabelle 1) bei 2-3 h BLO CO_2, um alle erwachsenen Fliegen aus den männlichen Sammelfläschchen zu entfernen (Schritt 2), aber lassen Sie in den nächsten Stunden weitere Fliegen ausnächster Linie.
2. Entfernen Sie in den nächsten 5-6 h alle 20-30 min mit CO₂ neu geschlossene Fliegen und legen Sie jedes Männchen mit dem Aspirator in einen individuellen Brunnen des Gehäuseblocks (Schritt 3)(Abbildung 2B).
3. Versiegeln Sie den Brunnen mit der KlebenPCR-Folie.
   HINWEIS: Dies ist ein entscheidender Schritt im Protokoll. Die Männchen sollten häufig gesammelt werden. Gesammelte Männchen sollten im Wohnblock in der Nähe der Zeit der Eclosion isoliert werden, wenn sie blasse Pigmentierung und das Vorhandensein des Meconiums im durchscheinenden Abdomen zeigen.
   HINWEIS: Die schonende Verwendung des Aspirators ermöglicht die Übertragung von Fliegen; Eine unsachgemäße Verwendung belastet jedoch die Fliegen, was zu Abweichungen im Test führt (siehe Diskussion).
4. Ziel ist es, bis zu 48 Männchen pro Genotyp zu sammeln. Dies bietet einen kleinen Überschuss auf die maximale Anzahl von Männchen für die Analyse von naiven und trainierten Bedingungen benötigt, so dass für einige Verluste während späterer Transferschritte.

6. Ausbildung

1. Entfernen Sie die Fliegen aus der Gegenflasche (Schritt 4.2) mit CO₂ und trennen Sie die prämated Weibchen von den Männchen.
2. Mit dem Aspirator fügen Sie jedem Brunnen in einer Reihe eines neuen Wohnblocks ein einzelnes anästhesisiertes, prämateiertes Weibchen hinzu.
3. Mit dem Aspirator und ohne Anästhesie, übertragen Sie ein individuelles naives Männchen aus dem in Schritt 5.2 aufgestellten Wohnblock in den Brunnen, der ein prämated Weibchen enthält. Nachdem das Männchen in den Brunnen gelegt wurde, sofort mit dem Klebefilm wieder versiegeln; lassen Sie das Männchen nicht entkommen.
   HINWEIS: Übertragen Sie männliche Fliegen vom Aspirator auf den Wohnblock, indem Sie ihr natürliches "negatives Geotaxis"-Verhalten nutzen.
4. Wiederholen Sie die Schritte 6.2-6.3, bis genügend männlich-weibliche Paare festgestellt werden. Idealerweise stellen Sie 24 Paare, zwei volle Reihen eines Gehäuseblocks, pro Genotyp. Lassen Sie die verbliebenen naiven Männchen im ursprünglichen Wohnblock in Schritt 5.2 eingerichtet.
5. Lassen Sie die männlichen und weiblichen Paare während des Trainings nicht gestört (Tabelle 2, Abbildung 1B).
   HINWEIS: Während dieser Zeit wird das Männchen hofieren und von der prämated weiblichen abgelehnt werden. Für Lernen und STM beträgt die Ausbildungszeit 1 h und für LTM die Ausbildungszeit 7-9 h.
6. Beenden Sie das Training (Tabelle 2, Abbildung 1B), indem Sie einen Aspirator verwenden, um das Männchen sanft von dem prämated weibchen zu trennen; anästhesie verwenden. Legen Sie das getrennte Männchen in einen neuen Wohnblock.
7. Verwenden Sie den Aspirator, um alle naiven Männchen sanft und ohne Narkose aus dem in Schritt 5.2 aufgestellten Wohnblock in einen neuen Wohnblock zu übertragen.
   HINWEIS: Dieser Schritt ist optional für STM und Lernen, aber es ist sehr wichtig für LTM, da die Fliegen für zusätzliche 24 h zum Testen von LTM untergebracht sind.
8. Lassen Sie bei STM und LTM die Männchen vor dem Test (Schritt 7) für 1 h bzw. 24 h ruhen (Tabelle 2, Abbildung 1B).
9. Zum Lernen testen Sie sofort die ausgebildeten und naiven Männchen (Schritt 7).

7. Testen

1. Sammeln Sie Fliegen von Paarungsfläschchen (Schritt 4.2) mit CO₂ und trennen Sie die prämated Weibchen von den Männchen.
2. Lassen Sie die Weibchen von der Anästhesie für mindestens 1 h in einer Durchstechflasche mit normaler Nahrung erholen.
3. Montieren Sie die Videorecorder im Voraus (Abbildung 2C), um alle Geräte vor Beginn der Tests bereit zu halten.
4. Starten Sie die Tests gemäß den verschiedenen Zeitplänen für das Lernen, STM und LTM (Tabelle 2, Abbildung 1B). Führen Sie Tests unmittelbar nach dem Training zum Lernen, 1 h nach dem Training für STM und 24 h nach dem Training für LTM durch.
5. Mit dem Aspirator, sanft übertragen Sie ein einzelnes Männchen aus dem ruhenden Wohnblock oder aus dem Trainingswohnblock, wenn das Lernen getestet wird (Schritt 6.7, trainiert; Schritt 6.8, naiv) auf die Hälfte einer Balzarena mit geschlossenem Teiler(Abbildung 2D; siehe Datei S1 für einen Bebauungsplan).
   HINWEIS: Die Verwendung des natürlichen "negativen Geotaxis"-Verhaltens sollte ausreichen, um die männlichen Fliegen vom Aspirator in die Balzarena zu übertragen.
6. Bewegen Sie das Einstiegsloch schnell in die nächste Arena und wiederholen Sie Schritt 7.5, bis alle 18 Arenen ein Männchen enthalten.
7. Mit dem Aspirator und ohne_CO2,fügen Sie ein prämated Weibliche (in Schritt 7.2 gesammelt) auf die andere Hälfte aller 18 Arenen.
8. Stellen Sie die Balzkammer vorsichtig unter die Kamera, mit der Öffnung der Brunnen nach unten (Abbildung 2C).
9. Entfernen Sie den Teiler der Arenen, um eine direkte Interaktion zwischen den Männchen und den prämated Weibchen zu ermöglichen.
10. Beginnen Sie sofort mit der Aufzeichnung des Verhaltens für mindestens 10 min.
    HINWEIS: Bei Verwendung eines Zwei-Kamera-Setups kann die parallele Aufzeichnung von zwei Balzplatten in überlappenden Zeitrahmen erfolgen, um die Effizienz zu maximieren.
11. Leeren Sie die Balzarenen mit einem handgehaltenen Staubsauger und lassen Sie die Balzkammer vor der Wiederverwendung lüften.
12. Wiederholen Sie Schritt 7.4-7.11, bis die Prüfung aller Genotypen und Bedingungen(d. h. naiv und trainiert) abgeschlossen ist.

8. Videodatenanalyse und -statistik

1. Berechnen Sie den Balzindex (CI), definiert als prozentsatz der Zeit, die die männlichen Gerichte während der ersten 10 min des Testzeitraums für jede einzelne männliche Fliege haben.
   HINWEIS: Dies kann manuell durch die Beobachtung des stereotypen Balzverhaltens (Abbildung 1A) oder durch die Verwendung von Computersoftware zur automatisierten Quantifizierung des Balzverhaltens erfolgen.
   HINWEIS: Es wird empfohlen, 40-60 Männer pro Zustand im Laufe von drei Tagen zu analysieren, um eine ausreichende statistische Leistung zu erreichen und die Konsistenz der CI-Daten zu beurteilen.
2. Berechnen Sie den Lernindex (LI), definiert als die prozentuale Reduktion des durchschnittlichen CI von ausgebildeten Männern im Vergleich zu naiven Männchen (LI = (CI_naiv – CI_trainiert) / CI_naiv). Bewerten Sie die LI für jeden Testtag, und vergleichen Sie sie mit der kumulativen LI, die aus allen Testtagen zusammen berechnet wird.
3. Erstellen Sie eine separate zweispaltige Registerkartendatendatei mit "Genotype" und "CI" als Header.
   HINWEIS: Bei diesen Überschriften wird die Groß-/Kleinschreibung berücksichtigt. Der Name des Genotyps für jedes CI muss aus einer Beschreibung des Genotyps bestehen, gefolgt von einem Unterstrich und der Trainingsbedingung(z. B. genotype_N und genotype_LTM usw., wobei N = naiv und LTM = Langzeitgedächtnis; siehe Zusatzdatei S2 für ein Beispiel). Diese Anmerkung ist wesentlich, da die Funktion analearn trainierte und naive Fliegen basierend auf den Zeichen identifiziert, die nach dem ersten Unterstrich in der Spalte "Genotype" vorhanden sind.
4. Verwenden Sie das Analearn R-Skript (Supplemental File S3), um einen Randomisierungstest durchzuführen, um die statistische Signifikanz von Unterschieden zwischen den LI-Werten aus verschiedenen Genotypen zu beurteilen.
   1. Beziehen Sie das Skript (Supplemental File S3) in R, das eine Funktion namens "analearn" definiert.
      HINWEIS: Die Funktionsdefinition lautet: analearn <- function(nboot = 10,000, naivelevel = 'N', refmutation = NA, datname = NA, header = TRUE, seed = NA, writeoutput = TRUE).
   2. Starten Sie die Funktion, indem Sie "analearn()" in die R-Befehlszeile eingeben und die zu analysierende Datendatei (produziert in Schritt 8.3) über das Pop-up-Fenster auswählen.
   3. Wählen Sie die Referenzmutation, die der Kontrollgenotyp ist, indem Sie die entsprechende Zahl eingeben und die Eingabetaste drücken.
      HINWEIS: Nach der Auswahl des Referenzgenotyps benötigt das Skript einige Sekunden, um 10.000 Bootstrap-Replikationen durchzuführen.
   4. Beachten Sie die Ausgabetabelle (Tabelle 3), die den Genotyp, die Lernbedingung(d. h.Lernen, STM oder LTM), den Mittelwert CI naiv, das mittlere CI trainiert, LI, die Differenz zwischen dem LI der Kontrolle im Vergleich zur Versuchsbedingung (LI dif), die Untergrenze (LL) und die obere Grenze (UL) des 95%-Konfidenzintervalls des LI dif und den p-Wert,der die Wahrscheinlichkeit angibt, dass es keine signifikante Differenz gibt, enthält.
      HINWEIS: analearn speichert eine Ausgabetextdatei in dem Verzeichnis, in dem sich die Datendatei befindet. Die Ausgabetabelle wird jedoch auch in der R-Studio-Konsole angezeigt. Der Standardname basiert auf dem Namen der bereitgestellten Datendatei.
   5. Es gibt mehrere Argumente in der analearn-Funktion, die verwendet werden können, um die Standardeinstellungen der Funktion zu ändern, um die Parameter des Bootstrappings anzupassen.
      HINWEIS: "nboot" definiert die Anzahl der Bootstrap-Replikationen und ist standardmäßig auf 10.000 festgelegt. Dieser Wert kann in eine beliebige ganzzahlige Zahl größer als Null geändert werden. In Tabelle 5 werden mehrere Argumente eingeschrieben, mit denen die Standardeinstellungen der Funktion geändert werden können. Es wird jedoch nicht empfohlen, Daten zu verwenden, die mit einer geringen Anzahl von Bootstrap-Replikationen erstellt werden.

Representative Results

Abbildung 1: Bestimmung des Courtship-Index und der experimentellen Übersicht. (A) Bilder, die ein stereotypes männliches Balzverhalten gegenüber einer weiblichen Fliege zeigen. Es werden verschiedene Stadien des Balzverhaltens gezeigt: Orientierung (I), folgende (II), Flügelschwingung (Verlängerung) und Abstich (III), Lecken (IV) und versuchte Kopulation (V). (B) Schematische Übersicht der Trainings- und Testzeiten im Verhältnis zum Inkubator-Lichtzyklus, in Stunden markiert. Trainingszeiten werden mit Balken angegeben, Ruhezeiten für STM und LTM werden mit einer gestrichelten Linie und der Teststartpunkt als Pfeil angezeigt. Beachten Sie, dass die Testzeit für LTM der Tag nach dem Training ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Ausrüstung für den Drosophila Courtship Conditioning Assay. (A) Der Gehäuseblock ist ein flacher, unterer Block mit 500 l Powerfood pro Brunnen. Es ist mit einer qPCR-Klebefolie mit mindestens 4 Löchern pro Bohrloch versiegelt, die mit einer Spritzennadel mit einem Durchmesser von 0,8 mm erstellt wurden. Einzelne Reihen werden längs in Streifen geschnitten, indem eine Rasierklinge verwendet wird, um das Öffnen und Schließen zu ermöglichen. (B) Der Aspirator wird für die sanfte Übertragung von männlichen und weiblichen Fliegen ohne Anästhesie benötigt. Der Einleger zeigt die Spitze des Aspirators, die mit einem Stück Baumwolle verschlossen ist, um die Fliegen in der Spitze zu halten. (C) Einrichtung eines Zwei-Kamera-Systems zur gleichzeitigen Aufzeichnung von zwei Balzkammern. (D) Eine Balzkammer mit 18 Arenen. Schiebelöcher werden verwendet, um die Fliegen in den Arenen zu platzieren. Die weißen Trennwände können gleichzeitig geöffnet werden, um interaktionen zwischen Den Männchen und Weibchen zu initiieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Tabelle 1: Beispielzeitleiste zum Testen von LTM über drei Replikationen an einzelnen Tagen.

	Allgemein	Sammeln	Zug	Test
Tag -11	Beginnen Sie vorgeghattete weibliche Sammlungskulturen (Schritt 1.3)
Tag -10	Startkulturen für die Sammlung männlicher Probanden (Schritt 2.2)
Tag 1		Rep. 1
Tag 2		Rep. 2
Tag 3		Rep. 3
Tag 4		Rep. 4	Rep. 1
Tag 5			Rep. 2	Rep. 1
Tag 6			Rep. 3	Rep. 2
Tag 7			Rep. 4	Rep. 3
Tag 8				Rep. 4
Tag 9	Videodatenanalyse und -statistik (Schritt 8)
rep = wiederholen

Tabelle 2: Trainingsdauer, Trainingszeiten und Testzeiten für Lernen, STM und LTM

	Lernen	Stm	Ltm
Trainingszeit	1 H.	1 H.	8 h.
Ruhezeit	0 h.	1 H.	• 24 h.
Trainingsbeginn	0 h. ALO	0 h. ALO	4 h. BLO
Trainingsstopp	1 h. ALO	1 h. ALO	4 h. ALO
Starttest	1 h. ALO	2 h. ALO	0 h. ALO (nächster Tag)
ALO = nach dem Einschalten der Lichter, BLO = vor dem Einschalten der Lichter, STM = Kurzzeitgedächtnis, LTM = Langzeitspeicher

Tabelle 3: Statistische Daten, die aus dem Analearn-Skript erstellt wurden.
Statistische Daten, die aus dem analearn-Skript erstellt wurden. Die Ausgabedatei des Bootstrapping R-Skripts, das den Genotyp, die Lernbedingung(d.h.Lern-, STM- oder LTM), den Mittelwert CI naiv, das mittlere CI trainiert, LI, die Differenz zwischen LI der Kontrolle im Vergleich zu experimentellen Bedingungen (LI dif), der Untergrenze (LL) und der oberen Grenze (UL) des 95%-Konfidenzintervalls von LI dif und dem p-Wert,der die Wahrscheinlichkeit angibt, dass es keine signifikante Ndifferenz gibt, enthält.

Genotyp	Lernen	Ci	Ci	Li	Li	Untere Grenze	Obergrenze	p-Wert
	Zustand	Naiv	Ausgebildet		Unterschied	(95% Konfizeszintervall)	(95% Konfizeszintervall)
Steuerung	Stm	0.467	0.116	0.752	Na	Na	Na	Na
Dhap-at-RNAi	Stm	0.699	0.257	0.633	0.119	-0.03	0.265	0.116
Steuerung	Ltm	0.59	0.384	0.348	Na	Na	Na	Na
Dhap-at-RNAi	Ltm	0.697	0.65	0.068	0.28	0.103	0.446	0.003

Ergänzungsdatei S1: Bebauungsplan einer Balzkammer. Die Datei kann mit jeder Anwendung geöffnet werden, die .stp-Erweiterungen (CAD-Dateien) zulässt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei S2: Beispiel einer Eingabedatei für das Analearn-Skript. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei S3: Das Analearn.R Skript. Die Datei kann mit R-studio geöffnet werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
P{KK101437}VIE-260B	VDRC	101437	Dhat-at-RNAi in 60100 background
P{KK108109}VIE-260B	-	-	Control-RNAi in 60100 background (gift from K. Keleman)
w+, UAS-dcr2/yhh;;elav-Gal4 (III)	-	-	panneuronal driver line
Containers for plant tissue culture	VWR	960177	175 mL plastic vials
Folded filters	Whatman	10311643	Filter paper to enlarge area flies can pupate on
Flat-bottom blocks (96-wells)	Qiagen	19579	Used for housing blocks
MicroAmp Clear Adhesive Film	Applied Biosystems	4306311	PCR adhesive film as lid on flat-bottom blocks
Razor blade	-	-	Any sharp will do
Needle	-	-	0.8 mm diameter
Aspirator	-	-	Cut a 1mL pipet tip with scissors in order to have two pieces. The narrow tip of the pipettip is placed as fly entrance in a ~80 cm flexible hose. To prevent a fly from getting in the hose, a normal piece of cotton or small mesh gaze is placed in between the tip and the hose. The other half of the pipettip can be used as mouth piece at the end of the hose.
Courtship chambers	-	-	file S1 can be opened with indicated CAD software
Camcorder	Sony	-	camera specification: >4M pixels, full HD.
For manual quantification, any simple video recording device has the potential to produce a video of sufficient quality to observe courtship behavior accurately. For automated quantification, there will likely be different requirements depending on the software to be used, and users should investigate this thoroughly if automated quantification is desired.
Name	Company	Catalog Number	Comments
power food
Agar	Sigma	A7002
Yeast	Bruggeman	-
Yeast extract	MP biomedicals	0210330391
Peptone	Sigma	P6838
Sucrose	Sigma	S9378
Glucose	Sigma	G7021
MgSO4	Sigma	M2643
CaCl2	Merck	1023780500
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	-
Yeast paste	-		yeast grains and water mixture in a 1:1 ratio
Name	Company	Catalog Number	Comments
normal food
Agar	MP biomedicals	215017890
Yeast	bruggeman	-
Corn flour	de Molen	-
Sugar	de Molen	-
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	-