Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Encyclopedia of Experiments

Drosophila Kurtisekondisjonering: En metode for å teste læring og minne i fluer

Overview

Denne videoen beskriver en klassisk kondisjoneringsanalyse som tester læring og hukommelse i Drosophila, kalt frierikondisjonering. Analysen er basert på reduksjon av mannlig frieri etter å ha opplevd en avvisning av en ikke-mottakelig prematert kvinne. Eksempelprotokollen viser et oppsett for prosedyren som kan brukes til å vurdere kort- og langtidshukommelse.

Protocol

Denne protokollen er et utdrag fra Koemans et al., Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory, J. Vis. Exp. (2017).

MERK: I protokollen som er beskrevet nedenfor, beskrives én replikering av innsamling, opplæring og testing. For å teste reproduserbarheten av resultatene, bør disse trinnene gjentas parallelt, på flere dager og med separate grupper av fluer (Tabell 1). Protokollen er basert på en 10 dagers livssyklus fra egg til voksen, som er normalt når oppdrett flyr under konstante forhold på 25 °C, 70 % fuktighet og en lys-/mørk syklus på 12 timer. Alle aspekter av denne protokollen antar at forholdene holdes konstant gjennom hele analysen. Tidene angis som timer før lysene slås på (BLO) eller etter at lysene slås på (ALO) i inkubatoren, da dette enkelt kan stilles inn avhengig av forskerens foretrukne tid på dagen. Bruk CO2-gass kun for den første samlingen av naive hannfluer og til innsamling av prematerte kvinner. Denne protokollen for frierikondisjonering består av følgende trinn:

  1. Etablering av prematerte kvinnelige samlingskulturer
  2. Etablering av kulturer for innsamling av mannlige testpersoner
  3. Forberedelse av boligblokker
  4. Etablering av parringshylser for produksjon av standardiserte prematerte kvinner
  5. Innsamling av mannlige forsøkspersoner
  6. Trening
  7. Testing
  8. Videodataanalyse og statistikk

1. Etablering av prematerte kvinnelige samlingskulturer

  1. Forbered powerfood. Kok 0,8% (m / v) agar, 8% (w /v) gjær, 2% (w / v) gjærekstrakt, 2% (w / v) peptone, 3% (w / v) sukrose, 6% (w / v) glukose, 0,05% (w / v) MgSO4og 0,05% (w / v) CaCl2 i vann i 15 min. La oppløsningen avkjøles til 70 °C før du tilsetter 0,05 % (m/v) metylparabene (FORSIKTIG: giftig) og 0,5 % (v/v) propionsyre (FORSIKTIG: giftig). Bland godt ved omrøring mens du kjøler videre til 50 °C for å oppnå en homogen løsning.
  2. Før maten størkner ved romtemperatur, tilsett ~ 50 ml powerfood til hvert 175 ml plast hetteglass. La maten avkjøles ytterligere. Lukk hetteglasset med en plugg.
    MERK: Powerfood er en spesialisert matblanding formulert spesielt for produksjon av et stort antall fluer, antagelig ved å indusere egglegging. Powerfood brukes ikke til å produsere mannlige fluer som vil bli brukt til atferdsanalyse (trinn 2) fordi det atypiske kostholdet og potensiell trengsel kan påvirke utviklingen.
  3. På dag -11 (Tabell 1), start 5-20 wildtype kulturer med ca 60-100 fluer (en blanding av menn og kvinner) i powerfood hetteglass; Disse vil bli brukt i trinn 4 for å produsere standardiserte prematerte kvinner. Legg til et filterpapir til hvert hetteglass for å øke området som larvene kan pupere på; Dette vil øke antall fluer som kan eclose.
  4. Gjenta regelmessig trinn 1.1-1.3 gjennom hele eksperimentet for å oppnå tilstrekkelige nylig ekloserende fluer som inngang for "etablering av parringshylser for produksjon av standardiserte prematerte kvinner" (trinn 4).

2. Etablering av kulturer for innsamling av mannlige testpersoner

  1. Forbered vanlig mat, laget med 0,5% (w / v) agar, 2,75 % (w/v) gjær, 5,2 % (w/v) maismel, 11 % (m/v) sukker, 0,05 % (w/v) metylsparbene og 0,5 % (v/v) propionsyre i vann, som beskrevet i trinn 1.1 og 1.2. Lukk hetteglassene i 175 ml plast med en hetteglassplugg.
  2. På dag -10 (Tabell 1), plasser ca 10-20 hanner med ca 30-75 jomfruhunner (Material / Utstyrsbord) i hvert 175 ml hetteglass som inneholder vanlig mat. Legg til et filterpapir for å øke overflatearealet for pupering og for å maksimere produktiviteten.
  3. Etablere tre til seks 175 ml hetteglass per genotype for å oppnå det nødvendige antall testpersoner.
    MERK: Flere hetteglass kan være nødvendig, avhengig av produktiviteten til ønsket genotype.

3. Utarbeidelse av boligblokker (Figur 2A)

  1. Smelt ca. 50 ml powerfood per boligblokk i en mikrobølgeovn, eller forbered den frisk.
  2. Tilsett 500 μL powerfood i hver brønn i en 96-brønns, flatbunnsblokk ved hjelp av en multidispenserpipette.
  3. La maten størkne ved romtemperatur.
  4. Dekk blokkene med PCR limfilm og bruk en nål til å lage minst 4 hull per brønn for å gi frisk luft til fluene.
  5. For å kunne åpne hver brønn, bruk et barberblad for å kutte limfilmen på langs mellom hver rad. La filmen være intakt i den ene enden av blokken.
  6. Blokkene kan lagres ved 4 °C i opptil 2 dager.
    MERK: La blokkene omkonlibrere til romtemperatur før bruk.

4. Etablering av parringshylser for produksjon av standardiserte prematerte kvinner

  1. På dag -1, fjern og kast alle voksne wildtype fluer fra premated kvinnelige samlingskulturer ved 2-5 h BLO.
  2. Samle fluer ved hjelp av aspiratoren (figur 2B) fra disse hetteglassene i intervaller på 2 til 3 timer(f.eks. ved 30 min, 2,5 t og 5 t ALO) og legg dem i et nytt powerfood hetteglass supplert med en liten mengde gjærpasta og filterpapir.
  3. For å unngå trengsel og for å fremme en optimal parring atmosfære, ikke overfør mer enn 150-200 fluer til hvert nytt hetteglass. Sørg for parring av alle kvinner ved å gi minst 25% menn. Sørg for at tilstrekkelige kvinner er til stede i parings hetteglassene for å imøtekomme størrelsen på eksperimentet.
    MERK: Siden dette er et avgjørende skritt i protokollen, må du sørge for at bare nyavledede fluer og ingen gamle fluer, larver eller pupper overføres til det nye parings hetteglasset.
  4. Inkuber disse "parringshettene" i fire dager for å gi tilstrekkelig tid til at alle kvinner har parret seg.

5. Innsamling av mannlige forsøkspersoner

  1. På dag 1 (Tabell 1) ved 2-3 h BLO, bruk CO2 for å fjerne alle voksne fluer fra de mannlige oppsamlingshetaltene (trinn 2), men la flere fluer eclose i løpet av de neste timene.
  2. I løpet av de neste 5-6 h, fjern nylig lukkede fluer hver 20-30 min ved hjelp av CO2 og legg hver mann i en individuell brønn av boligblokken (trinn 3) ved hjelp av aspiratoren (Figur 2B).
  3. Forsegle brønnen på nytt med den selvklebende PCR-filmen.
    MERK: Dette er et avgjørende skritt i protokollen. Hannene skal samles ofte. Innsamlede hanner skal isoleres i boligblokken nær eklosjonens tid, når de demonstrerer blek pigmentering og tilstedeværelsen av mekoniet i den gjennomsiktige magen.
    MERK: Forsiktig bruk av aspiratoren tillater overføring av fluer; Upassende bruk vil imidlertid stresse fluene og forårsake varians i analysen (se diskusjonen).
  4. Ta sikte på å samle opptil 48 menn per genotype. Dette gir et lite overskudd til det maksimale antallet menn som trengs for analyse av både naive og trente forhold, noe som gir noe tap under senere overføringstrinn.

6. Trening

  1. Fjern fluene fra hetteglasset (trinn 4.2) ved hjelp av CO2 og skill de prematerte hunnene fra hannene.
  2. Bruk aspiratoren, legg til en enkelt bedøvet, prematert kvinne til hver brønn i en rad av en ny boligblokk.
  3. Bruk aspiratoren og uten anestesi, overfør en individuell naiv mann fra boligblokken satt opp i trinn 5.2 til brønnen som inneholder en prematert kvinne. Etter at hanen er plassert i brønnen, forsegles den umiddelbart med limfilmen; ikke la hanen unnslippe.
    MERK: Overfør mannlige fluer fra aspiratoren til boligblokken ved å dra nytte av deres naturlige "negative geotaxis" oppførsel.
  4. Gjenta trinn 6.2-6.3 til nok mannlige-kvinnelige par er etablert. Ideelt sett, etablere 24 par, to fulle rader av en boligblokk, per genotype. La de gjenværende naive hannene ligge i den opprinnelige boligblokken som er satt opp i trinn 5.2.
  5. La de mannlige hunnparene være uforstyrret i løpet av treningsperioden (Tabell 2, Figur 1B).
    MERK: I løpet av denne tiden vil hanen domstol og bli avvist av den prematerte kvinnen. For læring og STM er treningsperioden 1 time og for LTM er treningsperioden 7-9 timer.
  6. Avslutt treningen (Tabell 2, Figur 1B) ved å bruke en aspirator til forsiktig å skille hannen fra den prematerte kvinnen; Bruk ikke anestesi. Plasser den separerte hannen i en ny boligblokk.
  7. Bruk aspiratoren til å overføre alle naive hanner forsiktig og uten anestesi fra boligblokken som er satt opp i trinn 5.2 til en ny boligblokk.
    MERK: Dette trinnet er valgfritt for STM og læring, men det er veldig viktig for LTM fordi fluene er plassert i ytterligere 24 timer for å teste LTM.
  8. For STM og LTM, la hannene hvile i henholdsvis 1 t og ~24 timer (Tabell 2, Figur 1B) før testing (trinn 7).
  9. For læring, test umiddelbart de trente og naive mennene (trinn 7).

7. Testing

  1. Samle fluer fra parring hetteglass (trinn 4.2) ved hjelp av CO2 og skille de prematerte hunnene fra hannene.
  2. La hunnene komme seg fra anestesi i minst 1 time i et hetteglass som inneholder vanlig mat.
  3. Monter videoopptakerne på forhånd (Figur 2C), slik at alt utstyret er klart før testingen starter.
  4. Start testingen i henhold til de ulike tidslinjene for læring, STM og LTM (Tabell 2, Figur 1B). Utfør testing umiddelbart etter trening for læring, 1 time etter trening for STM, og 24 timer etter trening for LTM.
  5. Bruk aspiratoren til å forsiktig overføre en person mann fra hvileboligblokken eller fra treningsboligblokken hvis læring testes (trinn 6.7, opplært; trinn 6.8, naiv) til halvparten av en frieriarena med skillelinjen lukket (Figur 2D; se Fil S1 for en byggeplan).
    MERK: Bruken av den naturlige "negative geotaxis" -oppførselen bør være tilstrekkelig til å overføre hannfluene fra aspiratoren til frieriarenaen.
  6. Flytt inngangshullet raskt, men forsiktig til neste arena, og gjenta trinn 7,5 til alle de 18 arenaene inneholder en mann.
  7. Bruk aspiratoren og uten CO2, legg til en prematert kvinne (samlet i trinn 7.2) til den andre halvdelen av alle 18 arenaer.
  8. Plasser frierikammeret forsiktig under kameraet, med åpningen av brønnene vendt ned (Figur 2C).
  9. Fjern skillelinjen på arenaene for å tillate direkte samspill mellom hannene og prematerte kvinner.
  10. Begynn umiddelbart å registrere oppførselen i minst 10 minutter.
    MERK: Når du bruker et oppsett med to kameraer, kan parallellopptak av to kurtiseplater gjøres i overlappende tidsrammer for å maksimere effektiviteten.
  11. Tøm frieriarenaene med en håndholdt støvsuger og la frierikammeret ventilere før gjenbruk.
  12. Gjenta trinn 7.4-7.11 til testingen av alle genotyper og forhold(dvs. naiv og opplært) er fullført.

8. Analyse og statistikk av videodata

  1. Beregn frieriindeksen (CI), definert som prosentandelen av tid som de mannlige domstolene i løpet av de første 10 min av testperioden, for hver enkelt mannlige fly.
    MERK: Dette kan gjøres manuelt ved å observere stereotypisk frieriatferd (figur 1A) eller ved å bruke dataprogramvare for automatisert kvantifisering av frieriatferd.
    MERK: Det anbefales å analysere 40-60 menn per tilstand i løpet av tre dager for å oppnå tilstrekkelig statistisk kraft og for å bedømme konsistensen av CI-dataene.
  2. Beregn læringsindeksen (LI), definert som prosentvis reduksjon i gjennomsnittlig KI for trente menn sammenlignet med naive menn (LI = (CInaiv – CItrent) / CInaiv). Evaluer LI for hver testdag, og sammenlign den med den kumulative LI beregnet fra alle testdager til sammen.
  3. Lag en egen tokolonners kategoridatafil med "Genotype" og "CI" som overskrifter.
    MERK: Disse overskriftene skiller mellom store og små bokstaver. Navnet på genotypen for hver CI må bestå av en beskrivelse av genotypen etterfulgt av et understrekingstegn og treningsbetingelsen (for eksempel genotype_N og genotype_LTM, etc., der N = naiv og LTM = langsiktig minne; se Tilleggsfil S2 for et eksempel). Denne merknaden er viktig, da funksjonen analearn vil identifisere trente og naive fluer basert på tegnene som er tilstede etter det første understrekingstegnet i "Genotype" -kolonnen.
  4. Bruk analearn R-skriptet (Supplemental File S3) til å utføre en randomiseringstest for å bedømme den statistiske betydningen av forskjeller mellom LI-verdiene fra forskjellige genotyper.
    1. Kilde skriptet (Supplemental File S3) i R, som definerer en funksjon som heter "analearn."
      MERK: Funksjonsdefinisjonen er: analearn <- funksjon(nboot = 10 000, naivelevel = 'N', refmutasjon = NA, datname = NA, header = TRUE, seed = NA, writeoutput = TRUE).
    2. Start funksjonen ved å skrive inn "analearn()" i R-kommandolinjen og velge datafilen som skal analyseres (produsert i trinn 8.3) via popup-vinduet.
    3. Velg referansemutasjonen, som er kontrollgenotypen, ved å skrive inn det tilsvarende tallet og trykke enter.
      MERK: Når du har valgt referansegenotypen, tar skriptet flere sekunder å utføre 10 000 bootstrap-replikeringer.
    4. Vær oppmerksom på utdatatabellen (tabell 3), som inneholder genotypen, læringstilstanden (dvs.læring, STM eller LTM), gjennomsnittlig CI naiv, gjennomsnittlig CI-trent, LI, forskjellen mellom LI for kontrollen sammenlignet med den eksperimentelle tilstanden (LI dif), den nedre grensen (LL) og øvre grense (UL) for LI dif-intervallets 95 % konfidensintervall, og p-verdien som indikerer sannsynligheten for at det ikke er noen signifikant forskjell.
      MERK: analearn lagrer en utdatatekstfil i katalogen der datafilen er plassert. Utdatatabellen vises imidlertid også i R-Studio-konsollen. Standardnavnet er laget basert på navnet på den angitte datafilen.
    5. Det er flere argumenter i analearn-funksjonen som kan brukes til å endre standardinnstillingene for funksjonen for å justere parametrene for bootstrapping.
      MERK: "nboot" definerer antall bootstrap replikerer og er satt til 10 000 som standard. Denne verdien kan endres til et hvilket som helst heltall som er større enn null. Tabell 5 viser flere argumenter som kan brukes til å endre standardinnstillingene for funksjonen. Det anbefales imidlertid ikke å bruke data som produseres med et lavt antall bootstrap-replikeringer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figure 1
Figur 1: Fastsettelse av frieriindeksen og eksperimentell oversikt. (A) Bilder som viser stereotypisk mannlig frieri oppførsel mot en kvinnelig flue. Ulike stadier av frieriadferd vises: orientering (I), følgende (II), vingevibrasjon (forlengelse) og tapping (III), slikking (IV) og forsøk på kopiering (V). (B) Skjematisk oversikt over trenings- og testtider i forhold til inkubatorlyssyklusen, merket i timer. Treningstider er indikert med stolper, hvileperioder for STM og LTM er indikert med en stiplet linje, og teststartpunktet er angitt som en pil. Vær oppmerksom på at testtiden for LTM er dagen etter trening. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Utstyr som brukes til Drosophila Courtship Conditioning Assay. (A) Boligblokken er en flat, bunnblokk med 500 μL powerfood per brønn. Den er forseglet med en qPCR limfilm med minst 4 hull per brønn som ble opprettet ved hjelp av en sprøytenål med en diameter på 0,8 mm. Individuelle rader kuttes på langs i strimler ved hjelp av et barberblad for å tillate åpning og lukking. (B) Aspiratoren er nødvendig for forsiktig overføring av mannlige og kvinnelige fluer uten bruk av anestesi. Innsettet viser spissen av aspiratoren, lukket med et stykke bomull for å holde fluene inne i spissen. (C) Oppsett av et to-kamera system for samtidig opptak av to frieri kamre. (D) Et frierikammer med 18 arenaer. Glidende inngangshull brukes til å plassere fluene i arenaene. De hvite skilleveggene kan åpnes samtidig for å initiere samspill mellom menn og kvinner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Eksempel tidslinje for testing av LTM over tre replikeringer på individuelle dager.

Generelt Samle Tog Test
dag -11 Start forhåndsmatte kvinnelige samlingskulturer (trinn 1.3)
dag -10 Start kulturer for innsamling av mannlige testpersoner (trinn 2.2)
dag 1 rep. 1
dag 2 rep. 2
dag 3 rep. 3
dag 4 rep. 4 rep. 1
dag 5 rep. 2 rep. 1
dag 6 rep. 3 rep. 2
dag 7 rep. 4 rep. 3
dag 8 rep. 4
dag 9 Videodataanalyse og statistikk (trinn 8)
rep = gjenta

Tabell 2: Treningsvarighet, treningstider og testtider for læring, STM og LTM

Læring Stm LTM
Treningstid 1 time. 1 time. 8 timer.
Hviletid 0 h. 1 time. - 24 timer.
starte trening 0 h. ALO 0 h. ALO 4 h. BLO
stoppe trening 1 t. ALO 1 t. ALO 4 h. ALO
starte test 1 t. ALO 2 t. ALO 0 h. ALO (neste dag)
ALO = etter at lysene er slått på, BLO = før lysene slås på, STM = korttidsminne, LTM = langtidsminne

Tabell 3: Statistiske data produsert fra Analearn Script.
Statistiske data produsert fra analearn-skriptet. Utdatafilen til bootstrapping R-skriptet som inneholder genotypen, læringstilstanden (dvs.læring, STM eller LTM), betyr CI naiv, gjennomsnittlig CI-trent, LI, forskjell mellom LI av kontrollen sammenlignet med eksperimentell tilstand (LI dif), nedre grense (LL) og øvre grense (UL) for 95% konfidensintervallet til LI dif, og p-verdiensom indikerer sannsynligheten for at det ikke er noen signifikant forskjell.

Genotype Læring Ci Ci Li Li Nedre grense Øvre grense p-verdi
Tilstand Naiv Trent Forskjellen (95 % konfektintervall) (95 % konfektintervall)
Kontroll Stm 0.467 0.116 0.752 Na Na Na Na
Dhap-at-RNAi Stm 0.699 0.257 0.633 0.119 -0.03 0.265 0.116
Kontroll LTM 0.59 0.384 0.348 Na Na Na Na
Dhap-at-RNAi LTM 0.697 0.65 0.068 0.28 0.103 0.446 0.003

Supplerende fil S1: Byggeplan for et frierikammer. Filen kan åpnes med alle programmer som tillater .stp utvidelser (CAD-filer). Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil S2: Eksempel på en inndatafil for Analearn-skriptet. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil S3: Analearn.r-skriptet. Filen kan åpnes med R-studio. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
P{KK101437}VIE-260B VDRC 101437 Dhat-at-RNAi in 60100 background
P{KK108109}VIE-260B - - Control-RNAi in 60100 background (gift from K. Keleman)
w+, UAS-dcr2/yhh;;elav-Gal4 (III) - - panneuronal driver line
Containers for plant tissue culture VWR 960177 175 mL plastic vials
Folded filters Whatman 10311643 Filter paper to enlarge area flies can pupate on
Flat-bottom blocks (96-wells) Qiagen 19579 Used for housing blocks
MicroAmp Clear Adhesive Film Applied Biosystems 4306311 PCR adhesive film as lid on flat-bottom blocks
Razor blade - - Any sharp will do
Needle - - 0.8 mm diameter
Aspirator - - Cut a 1mL pipet tip with scissors in order to have two pieces. The narrow tip of the pipettip is placed as fly entrance in a ~80 cm flexible hose. To prevent a fly from getting in the hose, a normal piece of cotton or small mesh gaze is placed in between the tip and the hose. The other half of the pipettip can be used as mouth piece at the end of the hose.
Courtship chambers - - file S1 can be opened with indicated CAD software
Camcorder Sony - camera specification: >4M pixels, full HD.
For manual quantification, any simple video recording device has the potential to produce a video of sufficient quality to observe courtship behavior accurately. For automated quantification, there will likely be different requirements depending on the software to be used, and users should investigate this thoroughly if automated quantification is desired.
Name Company Catalog Number Comments
power food
Agar Sigma A7002
Yeast Bruggeman -
Yeast extract MP biomedicals 0210330391
Peptone Sigma P6838
Sucrose Sigma S9378
Glucose Sigma G7021
MgSO4 Sigma M2643
CaCl2 Merck 1023780500
Methylparabene (CAUTION) Sigma H5501
Propionic acid (CAUTION) Sigma P1386
Demineralized water -
Yeast paste - yeast grains and water mixture in a 1:1 ratio
Name Company Catalog Number Comments
normal food
Agar MP biomedicals 215017890
Yeast bruggeman -
Corn flour de Molen -
Sugar de Molen -
Methylparabene (CAUTION) Sigma H5501
Propionic acid (CAUTION) Sigma P1386
Demineralized water -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

<em>Drosophila</em> Kurtisekondisjonering: En metode for å teste læring og minne i fluer
Play Video
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Kilde: Koemans, T. S., et al. Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory. J. Vis. Utt. (2017).

View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter