דרוזופילה (לא כולל) מיזוג חיזור: שיטה לבדיקת למידה וזיכרון בזבובים

Overview

סרטון זה מתאר מבחני התניה קלאסיים ה שבודקים למידה וזיכרון בדרוסופילה, הנקראת מיזוג חיזור. ההסתעפות מבוססת על הפחתת החיזור הגברי לאחר שחוותה דחייה על ידי נקבה שאינה פתוחה מראש. הפרוטוקול לדוגמה מציג כיוונון עבור ההליך שניתן להשתמש בו כדי להעריך זיכרון לטווח קצר וארוך.

Protocol

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Koemans ואח ', Drosophila חיזור מיזוג כמדד של למידה וזיכרון, J. Vis. Exp. (2017).

שים לב: בפרוטוקול המפורט להלן מתואר שכפול אחד של איסוף, הדרכה ובדיקות. על מנת לבדוק את השחזור של התוצאות, יש לחזור על צעדים אלה במקביל, בימים מרובים, ועם קבוצות נפרדות של זבובים (טבלה 1). הפרוטוקול מבוסס על מחזור חיים של 10 ימים בין ביצה למבוגר, וזה נורמלי בעת גידול זבובים בתנאים קבועים של 25 מעלות צלזיוס, 70% לחות, ומחזור אור / כהה 12 שעות. כל ההיבטים של פרוטוקול זה מניחים כי התנאים נשמרים קבוע לאורך כל ההסתעפות. הזמנים מצוינים כשעות לפני שהאורות נדלקים (BLO) או לאחר שהאורות נדלקים (ALO) באינקובטור, שכן ניתן להגדיר זאת בנוחות בהתאם לשעה המועדפת על החוקר ביום. השתמש בגז CO₂ רק עבור האוסף הראשוני של זבובים זכר נאיביים עבור אוסף של נקבות premated. פרוטוקול זה להתניה חיזור מורכב מהשלבים הבאים:

1. הקמת תרבויות אוסף נשיות מוקדמות
2. הקמת תרבויות לאיסוף נבדקים גברים
3. הכנת בלוקי דיור
4. הקמת בקבוקוני הזדווגות לייצור נקבות מתוקננות מראש
5. אוסף נבדקים גברים
6. אימון
7. בדיקות
8. ניתוח נתונים וסטטיסטיקה של נתוני וידאו

1. הקמת תרבויות אוסף נשים קדם-מותנות

1. הכינו מזון כוח. מרתיחים 0.8% (w / v) אגר, 8% (w / v) שמרים, 2% (w / v) תמצית שמרים, 2% (w / v) פפטון, 3% (w / v) סוכרוז, 6% (w / v) גלוקוז, 0.05% (w / v) MgSO₄, ו 0.05% (w / v) CaCl₂ במים במשך 15 דקות. אפשר לפתרון להתקרר ל-70°C לפני הוספת 0.05% (w/v) מתילפראבן(התראה: רעיל)ו-0.5% (v/v) חומצה פרופונית(התראה: רעילה). מערבבים היטב על ידי ערבוב תוך קירור נוסף ל 50 מעלות צלזיוס כדי להשיג פתרון הומוגני.
2. לפני שהמזון מתמצק בטמפרטורת החדר, מוסיפים כ-50 מ"ל של מזון חשמל לכל בקבוקון פלסטיק 175 מ"ל. אפשר לאוכל להתקרר עוד יותר. סגור את הבקבוקון באמצעות תקע.
   שים לב: Powerfood הוא תערובת מזון מיוחדת ניסח במיוחד לייצור של מספר גדול של זבובים, ככל הנראה על ידי גרימת הטלת ביצים. Powerfood אינו משמש לייצור זבובים זכרים שישמשו לניתוח התנהגות (שלב 2) מכיוון שהתזונת הלא טיפוסית והצפיפות הפוטנציאלית עשויות להשפיע על ההתפתחות.
3. ביום -11 (שולחן 1), להתחיל 5-20 תרבויות wildtype עם כ 60-100 זבובים (שילוב של זכרים ונקבות) בבקבוקונים powerfood; אלה ישמשו בשלב 4 כדי לייצר נקבות מתוקננות premated. הוסף נייר סינון לכל בקבוקון כדי להגדיל את האזור שבו הזחלים יכולים pupate; זה יגדיל את מספר הזבובים שיכולים eclose.
4. מעת לעת לחזור על שלבים 1.1-1.3 לאורך כל הניסוי כדי להשיג מספיק זבובים eclosing חדש כמו קלט עבור "הקמת בקבוקונים הזדווגות לייצור של נקבות premated מתוקננת" (שלב 4).

2. הקמת תרבויות לאיסוף נבדקים גברים

1. הכן מזון רגיל, עשה עם 0.5% (w / v) אגר, 2.75% (w /v) שמרים, 5.2% (w / v) קמח תירס, 11% (w / v) סוכר, 0.05% (w / v) מתילפרבן, ו 0.5% (v / v) חומצה פרופונית במים, כמתואר בשלבים 1.1 ו 1.2. סגרו את בקבוקוני הפלסטיק בגודל 175 מ"ל עם תקע בקבוקון זבוב.
2. ביום -10(שולחן 1),מקום על 10-20 גברים עם כ 30-75 נקבות בתולה(חומרים / ציוד שולחן)בכל בקבוקון 175 מ"ל המכיל מזון רגיל. הוסף נייר סינון כדי להגדיל את שטח הפנים של הגור ולמקסם את הפרודוקטיביות.
3. להקים שלושה עד שישה בקבוקונים 175 מ"ל לכל גנוטיפ כדי לקבל את המספר הנדרש של זכרים נבדק.
   שים לב: ייתכן שיהיה צורך בבקבוקונים נוספים, בהתאם לפרודוקטיביות של הגנוטיפ הרצוי.

3. הכנת בלוקי דיור (איור 2א)

1. ממיסים כ-50 מ"ל של מזון חשמל לכל גוש דיור במיקרוגל, או מכינים אותו טרי.
2. הוסף 500 μL של מזון כוח לכל באר של 96 באר, בלוק שטוח התחתון באמצעות פיפטה רב-חיונית.
3. אפשרו למזון להתמצק בטמפרטורת החדר.
4. לכסות את הבלוקים עם סרט דבק PCR ולהשתמש במחט לעשות לפחות 4 חורים לכל באר כדי לספק אוויר צח לזבובים.
5. על מנת להיות מסוגל לפתוח כל באר, להשתמש בסכין גילוח כדי לחתוך את הסרט דבק לאורך בין כל שורה. השאר את הסרט שלם בקצה אחד של הבלוק.
6. בלוקים ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד 2 ימים.
   שים לב: אפשרו לבלוקים להתייצב מחדש לטמפרטורת החדר לפני השימוש.

4. הקמת בקבוקוני הזדווגות לייצור נקבות מתוקננות

1. ביום -1, להסיר ולהשליך את כל זבובי בר למבוגרים מתרבויות אוסף נשים premated ב 2-5 שעות BLO.
2. לאסוף זבובים באמצעות השאיפה (איור 2B) מבקבוקונים אלה במרווחים של 2 עד 3 שעות(למשל, ב 30 דקות, 2.5 שעות, ו 5 שעות ALO) ומניחים אותם בקבוקון powerfood חדש בתוספת כמות קטנה של משחת שמרים ונייר סינון.
3. כדי למנוע צפיפות ולקדם אווירת הזדווגות אופטימלית, אין להעביר יותר מ-150-200 זבובים לכל בקבוקון חדש. להבטיח את ההזדווגות של כל הנקבות על ידי מתן לפחות 25% זכרים. ודא כי נקבות מספיקות נמצאות בבקבוקוני ההזדווגות כדי להתאים לגודל הניסוי.
   שים לב: מכיוון שמדובר בצעד מכריע בפרוטוקול, ודאו שרק זבובים טריים ולא זבובים ישנים, זחלים או גלמים מועברים לבקבוקון ההזדווגות החדש.
4. דגירה אלה "בקבוקונים הזדווגות" במשך ארבעה ימים כדי לאפשר מספיק זמן עבור כל הנקבות להזדווג.

5. אוסף הנבדקים הגבריים

1. ביום 1(טבלה 1)ב 2-3 שעות BLO, להשתמש CO₂ כדי להסיר את כל הזבובים הבוגרים מבקבוקוני אוסף זכר (שלב 2), אבל לתת זבובים יותר eclose בשעות הקרובות.
2. במהלך 5-6 השעות הבאות, הסר זבובים חדשים כל 20-30 דקות באמצעות CO₂ והכנס כל זכר לבאר בודדת של בלוק הדיור (שלב 3) באמצעות השואף (איור 2B).
3. לאטום מחדש את הבאר עם סרט PCR דבק.
   שים לב: זהו צעד מכריע בפרוטוקול. הזכרים צריכים להיאסף לעתים קרובות. זכרים שנאספו צריכים להיות מבודדים בבלוק הדיור קרוב לזמן eclosion, כאשר הם מראים פיגמנטציה חיוורת ואת נוכחותו של meconium בבטן שקופה.
   שים לב: שימוש עדין של השואף מאפשר העברת זבובים; עם זאת, שימוש לא הולם ידגיש את הזבובים, וגורם לשונות במבחן (ראה הדיון).
4. המטרה לאסוף עד 48 זכרים לכל גנוטיפ. זה מספק עודף קטן למספר המקסימלי של הזכרים הדרושים לניתוח של תנאים נאיביים ומאומנים כאחד, המאפשר אובדן מסוים בשלבי העברה מאוחרים יותר.

6. אימון

1. הסר את הזבובים מבקבוקון ההזדווגות (שלב 4.2) באמצעות CO₂ והפרד את הנקבות premated מן הזכרים.
2. באמצעות השואף, להוסיף נקבה אחת מורדמת, premated לכל באר בשורה אחת של בלוק דיור חדש.
3. באמצעות השואף וללא הרדמה, להעביר זכר נאיבי בודד מגוש הדיור שהוקם בשלב 5.2 לבאר המכילה נקבה premated. לאחר הזכר ממוקם לתוך הבאר, לאטום מחדש מיד עם הסרט דבק; אל תרשה לזכר לברוח.
   שים לב: העבר זבובים זכרים מהשאף לבלוק הדיור על ידי ניצול ההתנהגות הטבעית שלהם "גיאוטקסיס שלילי".
4. חזור על שלבים 6.2-6.3 עד שיוקמו מספיק זוגות זכר-נקבה. באופן אידיאלי, להקים 24 זוגות, שתי שורות מלאות של בלוק דיור, לכל גנוטיפ. השאירו את הזכרים התמימים הנותרים בבלוק הדיור המקורי שהוקם בשלב 5.2.
5. השאירו את הזוגות זכר-נקבה ללא הפרעה במהלך תקופת האימונים(לוח 2, איור 1B).
   שים לב: במהלך תקופה זו, הזכר יהיה בית המשפט ונדחה על ידי הנקבה premated. ללמידה ו STM, תקופת האימון היא 1 שעות עבור LTM, תקופת האימונים היא 7-9 שעות.
6. סיים את האימון (טבלה 2, איור 1B) באמצעות שאיפה להפריד בעדינות את הזכר מהנקבה המוקדמת; אין להשתמש בהרדמה. שים את הזכר המופרד בבלוק דיור חדש.
7. השתמש השואף להעביר את כל הזכרים תמימים בעדינות וללא הרדמה מגוש הדיור שהוקם בשלב 5.2 לגוש דיור חדש.
   שים לב: שלב זה הוא אופציונלי עבור STM ולמידה, אבל זה מאוד חשוב עבור LTM כי הזבובים שוכנים עבור 24 שעות נוספות כדי לבדוק LTM.
8. עבור STM ו- LTM, אפשר לזכרים לנוח במשך שעה אחת ו~ 24 שעות, בהתאמה (טבלה 2, איור 1B) לפני הבדיקה (שלב 7).
9. ללמידה, בדקו מיד את הזכרים המאומנים והנאיבים (שלב 7).

7. בדיקה

1. לאסוף זבובים מבקבוקונים הזדווגות (שלב 4.2) באמצעות CO₂ ולהפריד את הנקבות premated מן הזכרים.
2. תן לנקבות להתאושש מההרדמה לפחות 1 שעות בבקבוקון המכיל מזון רגיל.
3. הר את מקליטי הווידאו מראש (איור 2C), על מנת שכל הציוד יהיה מוכן לפני תחילת הבדיקה.
4. התחל את הבדיקות בהתאם לצירי הזמן השונים ללמידה, STM ו- LTM (טבלה 2, איור 1B). בצע בדיקות מיד לאחר אימון ללמידה, 1 שעות לאחר אימון STM, ו 24 שעות לאחר אימון עבור LTM.
5. באמצעות השואף, העבר בעדינות זכר בודד מגוש הדיור המנוחה או מבלוק הדיור של האימונים אם הלמידה נבחנת (שלב 6.7, מאומן; שלב 6.8, נאיבי) לחצי זירת חיזור כאשר המפריד סגור (איור 2D; ראה קובץ S1 לתוכנית בנייה).
   שים לב: השימוש בהתנהגות הטבעית של "גיאוטקסיס שלילי" צריך להספיק כדי להעביר את הזבובים הזכריים מהשאף לזירת החיזור.
6. הזז במהירות אך בעדינות את חור הכניסה לזירה הבאה וחזור על שלב 7.5 עד שכל 18 הזירות יכילו זכר אחד.
7. באמצעות השואף וללא CO₂, להוסיף נקבה אחת premated (שנאסף בשלב 7.2) לחצי השני של כל 18 זירות.
8. הניחו בזהירות את תא החיזור מתחת למצלמה, כשפתח הבארות פונה כלפי מטה (איור 2C).
9. הסר את המפריד של הזירות כדי לאפשר אינטראקציה ישירה בין הזכרים והנקבות premated.
10. מיד להתחיל להקליט את ההתנהגות לפחות 10 דקות.
    שים לב: בעת שימוש בהתקנה של שתי מצלמות, ההקלטה המקבילה של שתי לוחיות חיזור יכולה להיעשות בלוחות זמנים חופפים כדי למקסם את היעילות.
11. רוקנו את זירות החיזור באמצעות שואב אבק ידני ואפשרו לתא החיזור לאוורר לפני השימוש החוזר.
12. חזור על שלב 7.4-7.11 עד להשלמת הבדיקה של כל הגנוטיפים והתנאים(כלומר, נאיביים ומאומנים).

8. ניתוח נתוני וידאו וסטטיסטיקה

1. לחשב את מדד החיזור (CI), המוגדר כאחוז הזמן שבו בתי המשפט הגבריים במהלך 10 הדקות הראשונות של תקופת הבחינה, עבור כל זבוב זכר בודד.
   שים לב: ניתן לעשות זאת באופן ידני על ידי התבוננות בהתנהגות חיזור סטריאוטיפית (איור 1A) או על ידי שימוש בתוכנת מחשב לכימות אוטומטי של התנהגות החיזור.
   שים לב: מומלץ לנתח 40-60 גברים בכל תנאי במהלך שלושה ימים על מנת להשיג כוח סטטיסטי מספיק ולשפוט את העקביות של נתוני CI.
2. לחשב את מדד הלמידה (LI), המוגדר כירידה באחוזים ב- CI הממוצע של זכרים מאומנים בהשוואה לזכרים נאיביים (LI = (CI_נאיבי – CI_מאומן) / CI_נאיבי). הערך את ה- LI עבור כל יום של בדיקות והשווה אותו ל- LI המצטבר המחושב מכל ימי הבדיקה יחד.
3. יצירת קובץ נתונים נפרד בן שתי עמודות עם "Genotype" ו- "CI" ככותרות.
   שים לב: כותרות אלה הן תלויות רישיות. שם הגנוטיפ עבור כל CI חייב לכלול תיאור של הגנוטיפ ואחריו מקף תחתון ומצב האימון (למשל, genotype_N genotype_LTM וכו ', כאשר N = נאיבי ו- LTM = זיכרון לטווח ארוך; ראה קובץ משלים S2 לדוגמה). ביאור זה הוא חיוני, שכן הפונקציה analearn תזהה זבובים מאומנים ותמימים המבוססים על הדמויות הקיימות לאחר המקף התחתון הראשון בעמודה "גנוטיפ".
4. השתמש בקובץ ה- Script analearn R (קובץ משלים S3) כדי לבצע בדיקת אקראיות כדי לשפוט את המובהקות הסטטיסטית של הבדלים בין ערכי LI מגנוטיבים שונים.
   1. מקור הסקריפט (קובץ משלים S3) לתוך R, המגדיר פונקציה הנקראת "analearn".
      שים לב: הגדרת הפונקציה היא: analearn <- פונקציה(nboot = 10,000, naivelevel = 'N', הפרכה = NA, datname = NA, כותרת = TRUE, זרע = NA, writeoutput = TRUE).
   2. התחל את הפונקציה על-ידי הזנת "analearn()" בשורת הפקודה R ובחירת קובץ הנתונים שיש לנתח (הופק בשלב 8.3) דרך החלון המוקפץ.
   3. בחר את מוטציית ההפניה, שהיא גנוטיפ הבקרה, על-ידי הזנת המספר המתאים והקשה על enter.
      שים לב: לאחר בחירת גנוטיפ ההפניה, לקובץ ה- Script לוקח מספר שניות לבצע 10,000 עותקים משוכפלים של אתחול.
   4. שים לב לטבלת הפלט (טבלה 3), המכילה את הגנוטיפ, מצב הלמידה (כלומר,למידה, STM או LTM), ממוצע CI נאיבי, ממוצע CI מאומן, LI, ההבדל בין LI של הפקד לעומת המצב הניסיוני (LI dif), הגבול התחתון (LL) והמגבלה העליונה (UL) של מרווח הביטחון של 95% של Dif LI, ואת ערך pהמציין את ההסתברות כי אין הבדל משמעותי.
      הערה: analearn יאחסן קובץ טקסט פלט בספריה שבה ממוקם קובץ הנתונים. עם זאת, טבלת הפלט מופיעה גם במסוף R-Studio. שם ברירת המחדל נבנה בהתבסס על שם קובץ הנתונים שסופק.
   5. ישנם מספר ארגומנטים בפונקציה analearn שניתן להשתמש בהם כדי לשנות את הגדרות ברירת המחדל של הפונקציה כדי להתאים את הפרמטרים של אתחול.
      שים לב: "nboot" מגדיר את מספר השכפולים של אתחול ומוגדר כ- 10,000 כברירת מחדל. ניתן לשנות ערך זה לכל מספר שלם הגדול מאפס. טבלה 5 מגייסת מספר ארגומנטים בהם ניתן להשתמש כדי לשנות את הגדרות ברירת המחדל של הפונקציה. עם זאת, לא מומלץ להשתמש בנתונים המופקים עם מספר נמוך של עותקים משוכפלים של אתחול.

Representative Results

איור 1: קביעת מדד החיזור והסקירה הניסיונית. (A)תמונות המציגות התנהגות חיזור גברית סטריאוטיפית כלפי זבוב נקבה. מוצגים שלבים שונים של התנהגות חיזור: אוריינטציה (I), מעקב (II), רטט כנף (שלוחה) והקשה (III), ליקוק (IV) וניסיון להזדווגות (V). (ב)סקירה סכמטית של זמני אימון ובדיקה ביחס למחזור אור החממה, המסומן בשעות. זמני האימון מצוינים עם מייצגי פעילויות, תקופות מנוחה עבור STM ו- LTM מסומנות בקו מקווקו ונקודת ההתחלה של הבדיקה מסומנת כחץ. שים לב שזמן הבדיקה עבור LTM הוא היום לאחר האימון. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: ציוד המשמש לבדיקת מיזוג החיזור של דרוזופילה. (A)בלוק הדיור הוא שטוח, בלוק תחתון עם 500 μL של מזון כוח לכל באר. הוא אטום בסרט דבק qPCR עם לפחות 4 חורים לכל באר שנוצרו באמצעות מחט מזרק בקוטר 0.8 מ"מ. שורות בודדות נחתכות לאורך לרצועות באמצעות סכין גילוח כדי לאפשר פתיחה וסגירה. (B)השואף נדרש להעברה עדינה של זבובים זכריים ונקביים ללא שימוש בהרדמה. הכניסה מראה את קצה השואף, סגור עם חתיכת כותנה כדי לשמור על הזבובים בתוך הקצה. (ג)התקנה של מערכת שתי מצלמות להקלטה בו זמנית של שני תאי חיזור. (ד)חדר חיזור עם 18 זירות. חורי כניסה הזזה משמשים כדי למקם את הזבובים בזירות. ניתן לפתוח את המפרידים הלבנים בו זמנית כדי ליזום אינטראקציה בין הזכרים והנקבות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

טבלה 1: ציר זמן לדוגמה לבדיקת LTM על פני שלושה שכפולים בימים בודדים.

	כללי	לאסוף	הרכבת	מבחן
יום -11	התחל תרבויות אוסף נשים premated (שלב 1.3)
יום -10	התחל תרבויות עבור אוסף של נבדקים גברים (שלב 2.2)
היום הראשון		נציג 1
היום הראשון		נציג 2
יום 3		נציג 3
יום 4		נציג 4	נציג 1
יום 5			נציג 2	נציג 1
יום 6			נציג 3	נציג 2
יום 7			נציג 4	נציג 3
יום 8				נציג 4
יום 9	ניתוח נתונים וסטטיסטיקה של נתוני וידאו (שלב 8)
rep = חזרה

טבלה 2: משך אימון, זמני אימון ושעות בדיקה ללמידה, STM ו- LTM

	למידה	מצב STM	מספר LTM
זמן אימון	שעה.	שעה.	שמונה שעות.
זמן מנוחה	0 שעות.	שעה.	~ 24 שעות.
התחלת אימון	0 שעות. אלו	0 שעות. אלו	4 שעות. בלו
להפסיק להתאמן	1 שעות. אלו	1 שעות. אלו	4 שעות. אלו
התחל בדיקה	1 שעות. אלו	2 שעות. אלו	0 שעות. אלו (למחרת)
ALO = לאחר אורות להדליק, BLO = לפני האורות להדליק, STM = זיכרון לטווח קצר, LTM = זיכרון לטווח ארוך

טבלה 3: נתונים סטטיסטיים שהופקו מהתסריט של Analearn.
נתונים סטטיסטיים שהופקו מהסקריפט של האנליאrn. קובץ הפלט של סקריפט R bootstrapping המכיל את הגנוטיפ, מצב למידה (כלומר,למידה, STM, או LTM), ממוצע CI נאיבי, ממוצע CI מאומן, LI, ההבדל בין LI של הפקד לעומת מצב ניסיוני (LI dif), הגבול התחתון (LL) ואת הגבול העליון (UL) של מרווח ביטחון 95% של LI dif, ואת ערך pהמציין את ההסתברות כי אין הבדל משמעותי.

גנוטיפ (גנוטיפ)	למידה	Ci	Ci	Li	Li	גבול תחתון	גבול עליון	ערך p
	תנאי	תמים	מאומנים		ההבדל	(מרווח זמן של 95% קונפינציה)	(מרווח זמן של 95% קונפינציה)
שליטה	מצב STM	0.467	0.116	0.752	נה	נה	נה	נה
דאפ-אין-RNAi	מצב STM	0.699	0.257	0.633	0.119	-0.03	0.265	0.116
שליטה	מספר LTM	0.59	0.384	0.348	נה	נה	נה	נה
דאפ-אין-RNAi	מספר LTM	0.697	0.65	0.068	0.28	0.103	0.446	0.003

תיק משלים S1: בניית תוכנית של חדר חיזור. ניתן לפתוח את הקובץ עם כל יישום המאפשר סיומות .stp (CAD-files). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים S2: דוגמה של קובץ קלט עבור סקריפט Analearn. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים S3: סקריפט Analearn.R. ניתן לפתוח את הקובץ באמצעות R-studio. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
P{KK101437}VIE-260B	VDRC	101437	Dhat-at-RNAi in 60100 background
P{KK108109}VIE-260B	-	-	Control-RNAi in 60100 background (gift from K. Keleman)
w+, UAS-dcr2/yhh;;elav-Gal4 (III)	-	-	panneuronal driver line
Containers for plant tissue culture	VWR	960177	175 mL plastic vials
Folded filters	Whatman	10311643	Filter paper to enlarge area flies can pupate on
Flat-bottom blocks (96-wells)	Qiagen	19579	Used for housing blocks
MicroAmp Clear Adhesive Film	Applied Biosystems	4306311	PCR adhesive film as lid on flat-bottom blocks
Razor blade	-	-	Any sharp will do
Needle	-	-	0.8 mm diameter
Aspirator	-	-	Cut a 1mL pipet tip with scissors in order to have two pieces. The narrow tip of the pipettip is placed as fly entrance in a ~80 cm flexible hose. To prevent a fly from getting in the hose, a normal piece of cotton or small mesh gaze is placed in between the tip and the hose. The other half of the pipettip can be used as mouth piece at the end of the hose.
Courtship chambers	-	-	file S1 can be opened with indicated CAD software
Camcorder	Sony	-	camera specification: >4M pixels, full HD.
For manual quantification, any simple video recording device has the potential to produce a video of sufficient quality to observe courtship behavior accurately. For automated quantification, there will likely be different requirements depending on the software to be used, and users should investigate this thoroughly if automated quantification is desired.
Name	Company	Catalog Number	Comments
power food
Agar	Sigma	A7002
Yeast	Bruggeman	-
Yeast extract	MP biomedicals	0210330391
Peptone	Sigma	P6838
Sucrose	Sigma	S9378
Glucose	Sigma	G7021
MgSO4	Sigma	M2643
CaCl2	Merck	1023780500
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	-
Yeast paste	-		yeast grains and water mixture in a 1:1 ratio
Name	Company	Catalog Number	Comments
normal food
Agar	MP biomedicals	215017890
Yeast	bruggeman	-
Corn flour	de Molen	-
Sugar	de Molen	-
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	-