Drosophila Verkeringsconditionering: een methode om leren en geheugen in vliegen te testen

Overview

Deze video beschrijft een klassieke conditioneringstest die leren en geheugen test in Drosophila, verkeringsconditionering genoemd. De test is gebaseerd op de vermindering van mannelijke verkering na het ervaren van een afwijzing door een niet-ontvankelijke voorafgemateerde vrouw. Het voorbeeldprotocol toont een instelling voor de procedure die kan worden gebruikt om het kortetermijngeheugen en het langetermijngeheugen te beoordelen.

Protocol

Dit protocol is een fragment uit Koemans et al., Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory, J. Vis. Exp. (2017).

OPMERKING: In het onderstaande protocol wordt één replica van verzameling, training en testen beschreven. Om de reproduceerbaarheid van de resultaten te testen, moeten deze stappen parallel, op meerdere dagen en met afzonderlijke groepen vliegen worden herhaald (tabel 1). Het protocol is gebaseerd op een levenscyclus van 10 dagen van ei tot volwassene, wat normaal is bij het fokken van vliegen onder constante omstandigheden van 25 °C, 70% vochtigheid en een licht/donkere cyclus van 12 uur. Alle aspecten van dit protocol gaan ervan uit dat de omstandigheden gedurende de hele test constant worden gehouden. Tijden worden aangegeven als uren voordat de lichten gaan branden (BLO) of nadat de lichten in de incubator zijn ingeschakeld (ALO), omdat dit gemakkelijk kan worden ingesteld afhankelijk van het gewenste tijdstip van de onderzoeker. Gebruik CO_2-gas alleen voor de eerste verzameling naïeve mannelijke vliegen en voor de verzameling van voorgemateerde vrouwtjes. Dit protocol voor verkeringsconditionering bestaat uit de volgende stappen:

1. Oprichting van vooraf gepremateerde vrouwelijke collectieculturen
2. Instelling van culturen voor de verzameling van mannelijke proefpersonen
3. Voorbereiding van woonblokken
4. Oprichting van paringsflacons voor de productie van gestandaardiseerde voorgemateerde vrouwtjes
5. Inzameling van mannelijke proefpersonen
6. Opleiding
7. Testing
8. Videogegevensanalyse en statistieken

1. Oprichting van premated vrouwelijke collectieculturen

1. Bereid powerfood. Kook 0,8% (w/v) agar, 8% (w/v) gist, 2% (w/v) gistextract, 2% (w/v) pepton, 3% (w/v) sacharose, 6% (w/v) glucose, 0,05% (w/v) MgSO₄en 0,05% (w/v) CaCl₂ in water gedurende 15 min. Laat de oplossing afkoelen tot 70 °C voordat u 0,05% (m/v) methylparabene(LET OP: giftig)en 0,5% (v/v) propionzuur(LET OP: giftig)toevoegt. Meng goed door te roeren terwijl u verder afkoelt tot 50 °C om een homogene oplossing te verkrijgen.
2. Voordat het voedsel stolt bij kamertemperatuur, voeg ~ 50 ml powerfood toe aan elke plastic flacon van 175 ml. Laat het voedsel verder afkoelen. Sluit de flacon met een stekker.
   OPMERKING: Powerfood is een gespecialiseerd voedselmengsel dat speciaal is samengesteld voor de productie van grote aantallen vliegen, vermoedelijk door het opwekken van het leggen van eieren. Powerfood wordt niet gebruikt om mannelijke vliegen te produceren die zullen worden gebruikt voor gedragsanalyse (stap 2) omdat het atypische dieet en potentiële verdringing de ontwikkeling kunnen beïnvloeden.
3. Begin op dag -11(tabel 1)met 5-20 wildtypeculturen met ongeveer 60-100 vliegen (een mix van mannetjes en vrouwtjes) in powerfood-flacons; deze zullen in stap 4 worden gebruikt om gestandaardiseerde voorgematiseerde vrouwtjes te produceren. Voeg een filterpapier toe aan elke flacon om het gebied te vergroten waarop de larven kunnen verpoppen; dit zal het aantal vliegen verhogen dat kan eclose.
4. Herhaal regelmatig stap 1.1-1.3 gedurende het hele experiment om voldoende nieuw ecloserende vliegen te verkrijgen als input voor de "oprichting van paringsflacons voor de productie van gestandaardiseerde voorgematiseerde vrouwtjes" (stap 4).

2. Oprichting van culturen voor de verzameling mannelijke proefpersonen

1. Bereid normaal voedsel, gemaakt met 0,5% (w/v) agar, 2,75% (m/v) gist, 5,2% (m/v) maïsmeel, 11% (m/v) suiker, 0,05% (m/v) methylparabene en 0,5% (v/v) propionzuur in water, zoals beschreven in stap 1.1 en 1.2. Sluit de plastic flacons van 175 ml met een vliegenflaconplug.
2. Plaats op dag -10(tabel 1)ongeveer 10-20 mannetjes met ongeveer 30-75 maagdelijke vrouwtjes(materiaal/uitrustingstafel)in elke flacon van 175 ml met normaal voedsel. Voeg een filterpapier toe om het oppervlak voor verpopping te vergroten en de productiviteit te maximaliseren.
3. Stel drie tot zes flacons van 175 ml per genotype vast om het vereiste aantal proefpersonen te verkrijgen.
   OPMERKING: Afhankelijk van de productiviteit van het gewenste genotype kunnen er meer flacons nodig zijn.

3. Voorbereiding van woonblokken (figuur 2A)

1. Smelt ongeveer 50 ml powerfood per woonblok in een magnetron of bereid het vers.
2. Voeg 500 μL powerfood toe aan elke put van een blok met platte bodem van 96 putten met behulp van een pipet met meerderedispensers.
3. Laat het voedsel stollen bij kamertemperatuur.
4. Bedek de blokken met PCR-kleeffolie en gebruik een naald om ten minste 4 gaten per put te maken om de vliegen van frisse lucht te voorzien.
5. Om elke put te kunnen openen, gebruikt u een scheermesje om de kleeffolie in de lengte tussen elke rij te snijden. Laat de film intact aan één kant van het blok.
6. De blokken kunnen maximaal 2 dagen bij 4 °C worden bewaard.
   OPMERKING: Laat de blokken voor gebruik opnieuw op kamertemperatuur komen.

4. Oprichting van paringsflacons voor de productie van gestandaardiseerde voorgematiseerde vrouwtjes

1. Op dag -1, verwijder en gooi alle volwassen wildtype vliegen uit voorgematte vrouwelijke verzamelculturen om 2-5 uur BLO.
2. Verzamel vliegen met behulp van de aspirator (figuur 2B) uit deze flacons in intervallen van 2 tot 3 uur(bijv. op 30 min, 2,5 uur en 5 uur ALO) en plaats ze in een nieuwe powerfood flacon aangevuld met een kleine hoeveelheid gistpasta en filterpapier.
3. Om verdringing te voorkomen en een optimale paringssfeer te bevorderen, breng niet meer dan 150-200 vliegen over naar elke nieuwe flacon. Zorg voor de paring van alle vrouwtjes door ten minste 25% mannetjes te leveren. Zorg ervoor dat er voldoende vrouwtjes aanwezig zijn in de paringsflacons om de grootte van het experiment aan te passen.
   OPMERKING: Omdat dit een cruciale stap in het protocol is, moet u ervoor zorgen dat alleen vers eclosed vliegen en geen oude vliegen, larven of poppen worden overgebracht naar de nieuwe paringsflacon.
4. Incubeer deze "paringsflacons" gedurende vier dagen om voldoende tijd te hebben voor alle vrouwtjes om te paren.

5. Verzameling mannelijke proefpersonen

1. Op dag 1 (Tabel 1) om 2-3 uur BLO, gebruik CO₂ om alle volwassen vliegen uit de mannelijke verzamelflacons te verwijderen (stap 2), maar laat de komende uren meer vliegen sluiten.
2. Verwijder in de volgende 5-6 uur elke 20-30 minuten nieuw uitgeworpen vliegen met CO₂ en plaats elk mannetje in een individuele put van het woonblok (stap 3) met behulp van de aspirator (figuur 2B).
3. Sluit de put opnieuw af met de zelfklevende PCR-folie.
   OPMERKING: Dit is een cruciale stap in het protocol. De mannetjes moeten vaak worden verzameld. Verzamelde mannetjes moeten worden geïsoleerd in het woonblok dicht bij de tijd van eclosie, wanneer ze bleke pigmentatie en de aanwezigheid van het meconium in de doorschijnende buik aantonen.
   OPMERKING: Zacht gebruik van de aspirator maakt de overdracht van vliegen mogelijk; onjuist gebruik zal echter de vliegen belasten, wat variantie in de test veroorzaakt (zie de discussie).
4. Streef ernaar om maximaal 48 mannetjes per genotype te verzamelen. Dit zorgt voor een kleine overmaat aan het maximale aantal mannetjes dat nodig is voor de analyse van zowel naïeve als getrainde omstandigheden, waardoor wat verlies mogelijk is tijdens latere overdrachtsstappen.

6. Opleiding

1. Verwijder de vliegen uit de paringsflacon (stap 4.2) met CO₂ en scheid de voorgemateerde vrouwtjes van de mannetjes.
2. Voeg met behulp van de aspirator een enkele verdoofde, voorgematiseerde vrouw toe aan elke put in één rij van een nieuw woonblok.
3. Met behulp van de aspirator en zonder anesthesie, breng een individuele naïeve man van het woonblok opgezet in stap 5.2 naar de put met een voorgemateerde vrouw. Nadat het mannetje in de put is geplaatst, sluit u onmiddellijk opnieuw af met de kleeffolie; laat het mannetje niet ontsnappen.
   OPMERKING: Breng mannelijke vliegen over van de aspirator naar het woonblok door te profiteren van hun natuurlijke "negatieve geotaxis"-gedrag.
4. Herhaal stap 6.2-6.3 totdat er voldoende man-vrouw paren zijn vastgesteld. Idealiter, stel 24 paren, twee volledige rijen van een huisvestingsblok, per genotype vast. Laat de resterende naïeve mannetjes in het oorspronkelijke woonblok staan in stap 5.2.
5. Laat de man-vrouwparen ongestoord tijdens de trainingsperiode (tabel 2, figuur 1B).
   OPMERKING: Gedurende deze tijd zal de man het hof maken en worden afgewezen door de voorgeprogrammeerde vrouw. Voor leren en STM is de trainingsperiode 1 uur en voor LTM is de trainingsperiode 7-9 uur.
6. Beëindig de training (tabel 2, figuur 1B) met behulp van een aspirator om het mannetje voorzichtig te scheiden van het voorgemateerde vrouwtje; gebruik geen anesthesie. Plaats het gescheiden mannetje in een nieuw woonblok.
7. Gebruik de aspirator om alle naïeve mannetjes voorzichtig en zonder verdoving over te brengen van het in stap 5.2 ingestelde woonblok naar een nieuw woonblok.
   OPMERKING: Deze stap is optioneel voor STM en leren, maar het is erg belangrijk voor LTM omdat de vliegen nog eens 24 uur zijn gehuisvest om LTM te testen.
8. Laat de mannetjes voor STM en LTM respectievelijk 1 uur en ~24 uur rusten(tabel 2, figuur 1B)voordat ze worden getest (stap 7).
9. Test voor het leren onmiddellijk de getrainde en naïeve mannetjes (stap 7).

7. Testen

1. Verzamel vliegen uit paringsflacons (stap 4.2) met BEHULP VAN CO₂ en scheid de voorgemateerde vrouwtjes van de mannetjes.
2. Laat de vrouwtjes minstens 1 uur herstellen van de anesthesie in een flacon met normaal voedsel.
3. Monteer de videorecorders van tevoren(afbeelding 2C),zodat alle apparatuur klaar is voordat het testen begint.
4. Start het testen volgens de verschillende tijdlijnen voor leren, STM en LTM (Tabel 2, Figuur 1B). Voer testen uit direct na de training om te leren, 1 uur na de training voor STM en 24 uur na de training voor LTM.
5. Breng met behulp van de aspirator voorzichtig een individuele man over van het rusthuisblok of van het trainingshuisblok als het leren wordt getest (stap 6.7, getraind; stap 6.8, naïef) naar de helft van een verkeringsarena met de scheidingswand gesloten (Figuur 2D; zie Dossier S1 voor een bouwplan).
   OPMERKING: Het gebruik van het natuurlijke "negatieve geotaxis"-gedrag moet voldoende zijn om de mannelijke vliegen van de aspirator naar de verkeringsarena over te brengen.
6. Verplaats snel maar voorzichtig het ingangsgat naar de volgende arena en herhaal stap 7.5 totdat alle 18 arena's één mannetje bevatten.
7. Voeg met behulp van de aspirator en zonder CO₂een voorgemateerde vrouw (verzameld in stap 7.2) toe aan de andere helft van alle 18 arena's.
8. Plaats de verkeringskamer voorzichtig onder de camera, met de opening van de putten naar beneden (figuur 2C).
9. Verwijder de scheidingswand van de arena's om directe interactie tussen de mannetjes en voorgemateerde vrouwtjes mogelijk te maken.
10. Begin onmiddellijk met het opnemen van het gedrag gedurende ten minste 10 minuten.
    OPMERKING: Bij het gebruik van een opstelling met twee camera's kan de parallelle opname van twee verkeringsplaten worden uitgevoerd in overlappende tijdsbestekken om de efficiëntie te maximaliseren.
11. Maak de verkeringsarena's leeg met behulp van een handstofzuiger en laat de verkeringskamer ventileren voordat u ze opnieuw gebruikt.
12. Herhaal stap 7.4-7.11 totdat het testen van alle genotypen en aandoeningen(d.w.z. naïef en getraind) is voltooid.

8. Videogegevensanalyse en statistieken

1. Bereken de verkeringsindex (CI), gedefinieerd als het percentage tijd dat de mannelijke rechtbanken gedurende de eerste 10 minuten van de testperiode voor elke individuele mannelijke vlieg.
   OPMERKING: Dit kan handmatig worden gedaan door stereotiep verkeringsgedrag te observeren (figuur 1A) of door computersoftware te gebruiken voor geautomatiseerde kwantificering van verkeringsgedrag.
   OPMERKING: Het wordt aanbevolen om 40-60 mannen per aandoening in de loop van drie dagen te analyseren om voldoende statistische kracht te bereiken en de consistentie van de CI-gegevens te beoordelen.
2. Bereken de leerindex (LI), gedefinieerd als de procentuele afname van de gemiddelde CI van getrainde mannen in vergelijking met naïeve mannen (LI = (CI_naïef – CI_getraind) / CI_naïef). Evalueer de LI voor elke testdag en vergelijk deze met de cumulatieve LI berekend op basis van alle testdagen samen.
3. Maak een apart gegevensbestand met twee kolommen met "Genotype" en "CI" als kopteksten.
   OPMERKING: Deze rubrieken zijn hoofdlettergevoelig. De naam van het genotype voor elke CI moet bestaan uit een beschrijving van het genotype gevolgd door een onderstrepingsteken en de trainingsconditie(bijv. genotype_N en genotype_LTM, enz., waarbij N = naïef en LTM = langetermijngeheugen; zie Aanvullend dossier S2 voor een voorbeeld). Deze annotatie is essentieel, omdat de functie analearn getrainde en naïeve vliegen zal identificeren op basis van de tekens die aanwezig zijn na de eerste onderstrepingsteken in de kolom "Genotype".
4. Gebruik het analearn R-script (Supplemental File S3) om een randomisatietest uit te voeren om de statistische significantie van verschillen tussen de LI-waarden van verschillende genotypen te beoordelen.
   1. Bron het script (Supplemental File S3) in R, dat een functie definieert die "analearn" wordt genoemd.
      OPMERKING: De functiedefinitie is: analearn <- function(nboot = 10.000, naivelevel = 'N', refmutation = NA, datname = NA, header = TRUE, seed = NA, writeoutput = TRUE).
   2. Start de functie door "analearn()" in te voeren in de R-opdrachtregel en het te analyseren gegevensbestand (geproduceerd in stap 8.3) te selecteren via het pop-upvenster.
   3. Kies de referentiemutatie, het besturingsgenotype, door het overeenkomstige nummer in te voeren en op enter te drukken.
      OPMERKING: Nadat u het referentiegenotype hebt geselecteerd, duurt het enkele seconden voordat het script 10.000 bootstrap-replica's heeft uitgevoerd.
   4. Let op de uitvoertabel (tabel 3), die het genotype, de leervoorwaarde(d.w.z.leren, STM of LTM), de gemiddelde CI-naïeve, gemiddelde CI-getrainde, LI, het verschil tussen de LI van de controle ten opzichte van de experimentele toestand (LI dif), de ondergrens (LL) en bovengrens (UL) van het betrouwbaarheidsinterval van 95% van de LI-dif en de p-waardedie de waarschijnlijkheid aangeeft dat er geen significant verschil is, in acht neemt.
      OPMERKING: analearn slaat een uitvoertekstbestand op in de map waar het gegevensbestand zich bevindt. De uitvoertabel wordt echter ook weergegeven in de R-Studio-console. De standaardnaam wordt gemaakt op basis van de naam van het opgegeven gegevensbestand.
   5. Er zijn verschillende argumenten in de analearn-functie die kunnen worden gebruikt om de standaardinstellingen van de functie te wijzigen om de parameters van de bootstrapping aan te passen.
      OPMERKING: "nboot" definieert het aantal bootstrap-replica's en is standaard ingesteld op 10.000. Deze waarde kan worden gewijzigd in een geheel getal dat groter is dan nul. Tabel 5 bevat verschillende argumenten die kunnen worden gebruikt om de standaardinstellingen van de functie te wijzigen. Het wordt echter niet aanbevolen om gegevens te gebruiken die zijn geproduceerd met een laag aantal bootstrap-replica's.

Representative Results

Figuur 1: Bepaling van de Verkeringsindex en Experimenteel Overzicht. (A) Beelden die stereotiep mannelijk verkeringsgedrag naar een vrouwelijke vlieg tonen. Verschillende stadia van verkeringsgedrag worden getoond: oriëntatie (I), volgende (II), vleugeltrilling (extensie) en tikken (III), likken (IV) en poging tot copulatie (V). (B) Schematisch overzicht van trainings- en testtijden ten opzichte van de incubatorlichtcyclus, gemarkeerd in uren. Trainingstijden worden aangegeven met balken, rusttijden voor STM en LTM worden aangegeven met een stippellijn en het teststartpunt wordt aangegeven als een pijl. Houd er rekening mee dat de testtijd voor LTM de dag na de training is. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2: Apparatuur gebruikt voor de Drosophila Courtship Conditioning Assay. (A) Het woonblok is een plat, bodemblok met 500 μL powerfood per put. Het is verzegeld met een qPCR-kleeffolie met ten minste 4 gaten per put die zijn gemaakt met een spuitnaald met een diameter van 0,8 mm. Individuele rijen worden in de lengte in reepjes gesneden met behulp van een scheermesje om openen en sluiten mogelijk te maken. (B) De aspirator is nodig voor de zachte overdracht van mannelijke en vrouwelijke vliegen zonder het gebruik van anesthesie. De inzet toont de punt van de aspirator, afgesloten met een stuk katoen om de vliegen binnen de punt te houden. (C) Installatie van een systeem met twee camera's voor de gelijktijdige opname van twee verkeringskamers. (D) Een verkeringskamer met 18 arena's. Glijdende ingangsgaten worden gebruikt om de vliegen in de arena's te plaatsen. De witte verdelers kunnen tegelijkertijd worden geopend om interactie tussen de mannetjes en vrouwtjes te initiëren. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Tabel 1: Voorbeeldtijdlijn voor het testen van LTM over drie replicates op afzonderlijke dagen.

	Algemeen	Verzamelen	Trein	Test
dag -11	Start premated vrouwelijke collectieculturen (stap 1.3)
dag -10	Startculturen voor het verzamelen van mannelijke proefpersonen (stap 2.2)
dag 1		rep. 1
dag 2		rep. 2
dag 3		rep. 3
dag 4		rep. 4	rep. 1
dag 5			rep. 2	rep. 1
dag 6			rep. 3	rep. 2
dag 7			rep. 4	rep. 3
dag 8				rep. 4
dag 9	Video data analyse en statistieken (stap 8)
rep = herhalen

Tabel 2: Trainingsduur, trainingstijden en testtijden voor leren, STM en LTM

	Leren	Stm	Ltm
Trainingstijd	1 uur.	1 uur.	8 uur.
Rusttijd	0 uur.	1 uur.	~ 24 uur.
start training	0 uur ALO	0 uur ALO	4 uur BLO
stoppen met trainen	1 uur ALO	1 uur ALO	4 uur ALO
start test	1 uur ALO	2 uur ALO	0 uur ALO (volgende dag)
ALO = nadat de lichten zijn ingeschakeld, BLO = voordat de lichten gaan branden, STM = kortetermijngeheugen, LTM = langetermijngeheugen

Tabel 3: Statistische gegevens die zijn geproduceerd op het analearn-script.
Statistische gegevens geproduceerd uit het analearn script. Het uitvoerbestand van het bootstrapping R-script met het genotype, leervoorwaarde(d.w.z., leren, STM of LTM), gemiddelde CI naïef, gemiddelde CI getraind, LI, verschil tussen LI van de controle in vergelijking met experimentele conditie (LI dif), de ondergrens (LL) en bovengrens (UL) van het 95% betrouwbaarheidsinterval van LI dif, en de p-waardedie de waarschijnlijkheid aangeeft dat er geen significant verschil is.

Genotype	Leren	Ci	Ci	Li	Li	Ondergrens	Bovengrens	p-waarde
	Voorwaarde	Naïef	Opgeleid		Verschil	(95% betrouwbaarheidsinterval)	(95% betrouwbaarheidsinterval)
Controle	Stm	0.467	0.116	0.752	NA	NA	NA	NA
Dhap-bij-RNAi	Stm	0.699	0.257	0.633	0.119	-0.03	0.265	0.116
Controle	Ltm	0.59	0.384	0.348	NA	NA	NA	NA
Dhap-bij-RNAi	Ltm	0.697	0.65	0.068	0.28	0.103	0.446	0.003

Aanvullend dossier S1: Bouwplan van een verkeringskamer. Het bestand kan worden geopend met elke toepassing die .stp-extensies (CAD-bestanden) toestaat. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand S2: voorbeeld van een invoerbestand voor het Analearn-script. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand S3: Het Analearn.R Script. Het bestand kan worden geopend met R-studio. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
P{KK101437}VIE-260B	VDRC	101437	Dhat-at-RNAi in 60100 background
P{KK108109}VIE-260B	-	-	Control-RNAi in 60100 background (gift from K. Keleman)
w+, UAS-dcr2/yhh;;elav-Gal4 (III)	-	-	panneuronal driver line
Containers for plant tissue culture	VWR	960177	175 mL plastic vials
Folded filters	Whatman	10311643	Filter paper to enlarge area flies can pupate on
Flat-bottom blocks (96-wells)	Qiagen	19579	Used for housing blocks
MicroAmp Clear Adhesive Film	Applied Biosystems	4306311	PCR adhesive film as lid on flat-bottom blocks
Razor blade	-	-	Any sharp will do
Needle	-	-	0.8 mm diameter
Aspirator	-	-	Cut a 1mL pipet tip with scissors in order to have two pieces. The narrow tip of the pipettip is placed as fly entrance in a ~80 cm flexible hose. To prevent a fly from getting in the hose, a normal piece of cotton or small mesh gaze is placed in between the tip and the hose. The other half of the pipettip can be used as mouth piece at the end of the hose.
Courtship chambers	-	-	file S1 can be opened with indicated CAD software
Camcorder	Sony	-	camera specification: >4M pixels, full HD.
For manual quantification, any simple video recording device has the potential to produce a video of sufficient quality to observe courtship behavior accurately. For automated quantification, there will likely be different requirements depending on the software to be used, and users should investigate this thoroughly if automated quantification is desired.
Name	Company	Catalog Number	Comments
power food
Agar	Sigma	A7002
Yeast	Bruggeman	-
Yeast extract	MP biomedicals	0210330391
Peptone	Sigma	P6838
Sucrose	Sigma	S9378
Glucose	Sigma	G7021
MgSO4	Sigma	M2643
CaCl2	Merck	1023780500
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	-
Yeast paste	-		yeast grains and water mixture in a 1:1 ratio
Name	Company	Catalog Number	Comments
normal food
Agar	MP biomedicals	215017890
Yeast	bruggeman	-
Corn flour	de Molen	-
Sugar	de Molen	-
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	-