Overview
このビデオでは、求愛コンディショニングと呼ばれる ショウジョウバエで学習と記憶をテストする古典的なコンディショニングアッセイについて説明します。このアッセイは、受容性のない前受刑者の女性による拒絶反応を経験した後の男性の求愛の減少に基づいている。プロトコルの例は、短期および長期のメモリを評価するために使用できる手順のセットアップを示しています。
Protocol
このプロトコルは、Koemans らからの抜粋です, 学習と記憶の尺度として ショウジョウバエ 求愛コンディショニング, J. Vis. Exp. (2017).
注:以下に概説するプロトコルでは、収集、トレーニング、およびテストの 1 つの複製について説明します。結果の再現性をテストするために、これらのステップは、複数の日に、および別々のハエのグループで並行して繰り返されるべきです(表1)。このプロトコルは、卵から成体までの10日間のライフサイクルに基づいており、25°C、湿度70%、および12時間の明暗サイクルの一定の条件下でハエを飼育する場合は正常です。このプロトコルのすべての側面は、条件がアッセイ全体を通して一定に保たれていることを前提としています。時間は、インキュベーターでライトが点灯する数時間前(BLO)またはインキュベーターで点灯(ALO)後に示され、これは研究者の好みの時間帯に応じて便利に設定できます。CO2ガスは、ナイーブオスハエの最初のコレクションと、プレメートされたメスのコレクションにのみ使用してください。この求愛条件付けのプロトコルは、次の手順で構成されます。
- 女性コレクション文化の確立
- 男性被験者の収集のための文化の確立
- 住宅ブロックの準備
- 標準化された前入れ女性の生産のための交配バイアルの確立
- 男性被験者の集合
- 訓練
- テスティング
- ビデオデータ分析と統計
1. 女性コレクション文化の確立
- パワーフードを準備します。沸騰 0.8%(w/v)寒天、8%(w/v)酵母、2%(w/v)酵母エキス、2%(w/v)ペプトン、3%(w/v)スクロース、6%(w/v)グルコース、0.05%(w/v)MgSO4、および0.05%(w/vCaCl) 0.05%(w/v)メチルパラベーン(注意:有毒)および0.5%(v/v)プロピオン酸(注意:有毒)を加える前に、溶液を70°Cに冷却させます。さらに50°Cまで冷却しながら撹拌しながらよく混合し、均質な溶液を得た。
- 食品が室温で固まる前に、各175 mLプラスチックバイアルにパワーフードの〜50 mLを加えます。食べ物をさらに冷まします。プラグでバイアルを閉じます。
注: パワーフードは、おそらく産卵を誘発することによって、ハエの多数の生産のために特別に配合された特殊な食品混合物です。パワーフードは、非定型食や潜在的な混雑が発達に影響を与える可能性があるため、行動分析(ステップ2)に使用される雄のハエを生産するために使用されません。 - 日 -11 (表 1) では、パワーフード バイアルに約 60 ~100 匹のハエ (オスとメスが混在) で 5~20 個の野生型文化を始めます。これらは、標準化されたプリメートされた女性を生産するためにステップ4で使用されます。各バイアルにフィルターペーパーを追加して、幼虫が子犬を育てる領域を増やします。これにより、閉じることができるハエの数が増加します。
- 実験全体を通してステップ1.1~1.3を定期的に繰り返し、「標準化された前産雌の生産のための交配バイアルの確立」の入力として十分な新しく閉鎖ハエを得る(ステップ4)。
2. 男性被験者の収集に関する文化の確立
- 0.5%(w/v)寒天、2.75%(w/v)酵母、5.2%(w/v)トウモロコシ粉、11%(w/v)砂糖、0.05%(w/v)メチルパラベイン、および0.5%(v/v)プロピオン酸を水に用意します。フライバイアルプラグで175mLプラスチックバイアルを閉じます。
- 日-10(表1)では、通常の食品を含む各175mLバイアルに約30〜75人の処女女性(材料/機器テーブル)を持つ約10〜20人の男性を配置します。フィルターペーパーを追加して、子犬の表面積を大きくし、生産性を最大化します。
- 遺伝子型あたり3〜6個の175 mLバイアルを確立し、必要な被験対象男性数を得る。
注: 所望の遺伝子型の生産性に応じて、より多くのバイアルが必要とされ得る。
3. ハウジングブロックの準備(図2A)
- 電子レンジでハウジングブロックあたり約50mLのパワーフードを溶かしたり、新鮮な準備をしてください。
- マルチディスペンサーピペットを使用して、96ウェル、フラットボトムブロックの各ウェルに500 μLのパワーフードを追加します。
- 食品を室温で固めます。
- ブロックをPCR粘着フィルムで覆い、針を使用してハエに新鮮な空気を与えるために井戸あたり少なくとも4つの穴を作ります。
- 各ウェルを開くことができるように、カミソリの刃を使用して各列の間の粘着フィルムを縦に切断します。フィルムはブロックの一方の端にそのまま残します。
- ブロックは4°Cで2日間保存することができます。
注: 使用前にブロックを室温に再平衡化します。
標準化された前入れ女性の生産のための交配バイアルの確立
- 1日目、2-5時間BLOでプレメートされた女性コレクション培養物からすべての成体野生型ハエを取り除いて捨てます。
- これらのバイアルから2~3時間間隔(例えば、30分、2.5時間、5時間ALO)でアスピレーター(図2B)を使用してハエを採取し、少量のイーストペーストとフィルターペーパーを補充した新しいパワーフードバイアルに入れる。
- 混雑を避け、最適な交配雰囲気を促進するために、150-200以上のハエを各新しいバイアルに転送しないでください。少なくとも25%の男性を提供することにより、すべての女性の交配を確保します。実験の大きさに合わせて、十分なメスが交配バイアルに存在することを確認してください。
注: これはプロトコルの重要なステップであるため、閉鎖されたばかりのハエと古いハエ、幼虫、または子犬が新しい交配バイアルに移らないようにしてください。 - すべての女性が交尾するのに十分な時間を確保するために、これらの「交配バイアル」を4日間インキュベートします。
5. 男性の被験者のコレクション
- 1日目(表1)の2-3時間BLOでは、CO2を使用して雄のコレクションバイアルからすべての成体ハエを取り除きます(ステップ2)が、今後数時間でより多くのハエを閉じてみましょう。
- 次の5〜6時間にわたって、CO2を使用して20〜30分ごとに新たに閉鎖されたハエを取り除き、各男性を吸引器を使用してハウジングブロックの個々の井戸に入れる(ステップ3)。
- 粘着PCRフィルムでウェルを再密封します。
注: これはプロトコルの重要なステップです。男性は頻繁に収集する必要があります。採取された男性は、半透明の腹部に淡い色素沈着とメコニウムの存在を示すとき、エブロセンの時間に近いハウジングブロックで隔離する必要があります。
注: 吸引器の穏やかな使用はハエの移動を可能にする;しかし、不適切な使用はハエにストレスを与え、アッセイに差異を引き起こす(議論参照)。 - 遺伝子型あたり最大48人の男性を収集することを目指します。これは、ナイーブと訓練された条件の両方の分析に必要な男性の最大数に小さな過剰を提供し、後の転送ステップ中にいくつかの損失を可能にします。
6. トレーニング
- CO2を使用して交配バイアル(ステップ4.2)からハエを取り除き、プリメートされたメスを雄から分離する。
- 吸引器を使用して、新しいハウジングブロックの1列の各井戸に単一の麻酔を受けた、前食化した女性を追加します。
- 麻酔なしで、麻酔なしで、ステップ5.2で設定されたハウジングブロックから、プレメートされた女性を含む井戸に個々のナイーブな男性を移す。男性が井戸に入れられた後、すぐに粘着フィルムで再シールします。男性が脱出することを許可しないでください。
注: 自然な「負のジオタキシス」行動を利用して、男性のハエを吸引器からハウジングブロックに移します。 - 十分な男性と女性のペアが確立されるまで、ステップ6.2-6.3を繰り返します。理想的には、24組、ハウジングブロックの2つの完全な行を遺伝子型ごとに確立します。ステップ5.2で設定された元の住宅ブロックに残りのナイーブな男性を残します。
- トレーニング期間中は男女ペアを邪魔されずに残します(表2、図1B)。
注: この間、男性は裁判を行い、プレメートされた女性によって却下されます。学習とSTMの場合、トレーニング期間は1時間、LTMの場合、トレーニング期間は7-9時間です。 - 実習を終了する (表 2, 図 1B) を、吸引器を使用して、男性と前置の女性を穏やかに分離します。麻酔を使用しないでください。分離した男性を新しいハウジングブロックに入れる。
- この吸入器を使用して、ステップ5.2で設置されたハウジングブロックから新しいハウジングブロックに、麻酔なしですべての素朴な男性を優しく転送します。
注: このステップはSTMと学習にはオプションですが、ハエはLTMをテストするためにさらに24時間収容されるため、LTMにとって非常に重要です。 - STMおよびLTMの場合、男性はテスト前にそれぞれ1時間と〜24時間(表2、図1B)のために休むことを許可する(ステップ7)。
- 学習のために、訓練を受けた素朴な男性をすぐにテストします(ステップ7)。
7. テスト
- CO2を使用して交配バイアル(ステップ4.2)からハエを収集し、男性から前生みのメスを分離します。
- 女性は、通常の食品を含むバイアルで少なくとも1時間麻酔から回復させましょう。
- テスト開始前にすべての機器を準備するために、ビデオレコーダーを事前に取り付けます(図2C)。
- 学習用の異なるタイムライン、STM、LTMに従ってテストを開始します(表2、図1B)。学習トレーニングの直後、STMのトレーニング後1時間、LTMのトレーニング後24時間テストを実施します。
- アスピレーターを使用して、学習がテストされている場合は、休息ハウジングブロックまたはトレーニングハウジングブロックから個々の男性を穏やかに移動します(ステップ6.7、訓練を受けました;ステップ6.8、ナイーブ)は、仕切りが閉じられたコートシップアリーナの半分に(図2D;建築計画のファイルS1を参照)。
注: 自然の「負のジオタキシス」行動の使用は、男性のハエを吸引器から求愛アリーナに移すのに十分であるべきです。 - 迅速に、しかし穏やかに次のアリーナにエントリホールを移動し、すべての18アリーナが1人の男性を含むまでステップ7.5を繰り返します。
- 吸引器を使用し、CO2を使用して、18のアリーナの残りの半分に1つのプレメートされた女性(ステップ7.2で収集)を追加します。
- 慎重に下向きの井戸の開口部を使用して、カメラの下に求愛室を配置します(図2C)。
- 男性とプレメイトされた女性の間の直接の相互作用を可能にするために、アリーナの仕切りを取り外します。
- 少なくとも10分間の動作の記録をすぐに開始します。
注: 2カメラのセットアップを使用する場合、2つの求愛プレートの並列記録は、効率を最大化するために、重複した時間枠で行うことができます。 - ハンドヘルド掃除機を使用して求愛アリーナを空にし、再使用する前に求愛室が換気できるようにします。
- ステップ7.4-7.11を繰り返して、すべての遺伝子型および条件(すなわち、 ナイーブで訓練された)のテストが完了するまで。
8. ビデオデータ分析と統計
- 求愛指数(CI)を計算し、各男性が飛行する個々の男性の最初の10分間に男性裁判所が行う時間の割合として定義されます。
注: これは、ステレオタイプの求愛行動(図1A)を観察するか、または求愛行動の自動定量化のためのコンピュータソフトウェアを使用することによって、手動で行うことができます。
注: 十分な統計的能力を達成し、CIデータの一貫性を判断するために、3日間にわたって条件ごとに40〜60人の男性を分析することをお勧めします。 - 学習指数(LI)を計算し、ナイーブ男性と比較して訓練を受けた男性の平均CIの減少率(LI =(CIナイーブ – CIトレーニング)/CIナイーブ) として定義されます。テストの各日の LI を評価し、すべてのテスト日を組み合わせて計算した累積 LI と比較します。
- ヘッダーとして「Genotype」と「CI」を使用して、別の 2 列のタブデータファイルを作成します。
注: これらの見出しは大文字と小文字を区別します。各CIの遺伝子型の名前は、遺伝子型の記述とアンダースコアとトレーニング条件(例えば、genotype_N やgenotype_LTMなど、N = ナイーブとLTM = 長期記憶;例えば補足ファイルS2を参照してください) で構成されている必要があります。関数 analearn は、「Genotype」列の最初のアンダースコアの後に存在する文字に基づいて訓練されたナイーブなハエを識別するので、この注釈は不可欠です。 -
analearn R スクリプト (補足ファイル S3) を使用して、異なる遺伝子型の LI 値間の差の統計的有意性を判断するために、ランダム化検定を実行します。
- スクリプト (補足ファイル S3) を R にソース化し、"analearn" という関数を定義します。
注: 関数定義は次のとおりです(nboot = 10,000、ナイーブレベル = 'N'、refmutation = NA、ダト名 = NA、ヘッダー = TRUE、シード = NA、書き込み出力 = TRUE)。 - R コマンド行に「analearn()」と入力し、ポップアップ・ウィンドウから分析するデータ・ファイル (ステップ 8.3 で作成) を選択して、関数を開始します。
- 対応する数値を入力し、Enterキーを押して、対照遺伝子型である参照変異を選択します。
注: 参照遺伝子型を選択すると、スクリプトは 10,000 ブートストラップの複製を実行するのに数秒かかります。 - 出力表(表3)は、遺伝子型を含む表(表3)、学習条件(すなわち、学習条件、STM、LTM)、平均CIナイーブ、平均CI訓練、LI、実験条件と比較した制御のLIとの差(LIdif)、LIdifの95%信頼区間の下限(LL)および上限(UL)、および p-値が有意な確率を示さないことを示す。
注: analearn は、データ ファイルが置かれているディレクトリに出力テキスト ファイルを格納します。ただし、出力テーブルは R-Studio コンソールにも表示されます。既定の名前は、指定されたデータ ファイルの名前に基づいて作成されます。 - analearn 関数には、ブートストラップのパラメーターを調整するために関数の既定の設定を変更するために使用できるいくつかの引数があります。
注: 「nboot」はブートストラップの複製の数を定義し、デフォルトで10,000に設定されています。この値は、0 より大きい任意の整数に変更できます。表 5 に、関数の既定の設定を変更するために使用できるいくつかの引数を示します。ただし、ブートストラップ・レプリケートの数が少ないデータを使用することはお勧めしません。
- スクリプト (補足ファイル S3) を R にソース化し、"analearn" という関数を定義します。
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Representative Results
図1:求愛指数の決定と実験概要 (A) 女性のハエに対するステレオタイプな男性の求愛行動を示す画像。求愛行動の異なる段階が示されている:オリエンテーション(I)、次の(II)、翼振動(延長)およびタッピング(III)、舐める(IV)、および交尾を試みた(V)。(B) インキュベーターの光サイクルに対するトレーニング時間とテスト時間の概略図。時間単位でマーク。トレーニング時間はバーで示され、STMとLTMの休息期間は破線で示され、テストの開始点は矢印として示されます。LTM のテスト時間はトレーニングの翌日であることに注意してください。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ショウジョウバエ求愛コンディショニングアッセイに使用される機器。(A)ハウジングブロックは、井戸あたり500 μLのパワーフードを備えた平坦なボトムブロックです。直径0.8mmの注射針を使用して作成されたウェルあたり少なくとも4つの穴を持つqPCR粘着フィルムで密封されています。個々の行は、開閉を可能にするためにカミソリの刃を使用してストリップに縦にカットされます。(B) 麻酔を使わずに、雄と雌のハエを穏やかに移すには、吸引器が必要である。インセットは、先端内のハエを保つために綿片で閉じた吸引器の先端を示しています。(C) 2 つの求愛室の同時録音のための 2 カメラ システムのセットアップ。(D) 18のアリーナを持つ求愛室。スライドエントリーホールは、アリーナにハエを配置するために使用されます。白い仕切りは、男性と女性の間の相互作用を開始するために同時に開くことができます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
表 1: 個々の日に 3 回のレプリケートで LTM をテストするタイムラインの例
| 全般 | 集める | 列車 | 試験 | |
| 日 -11 | プリメートされた女性コレクション文化を開始する(ステップ1.3) | |||
| 日 -10 | 男性の被験者のコレクションのための文化を開始する (ステップ 2.2) | |||
| 1日目 | 1. | |||
| 2日目 | 2. | |||
| 3日目 | 担当者 3 | |||
| 4日目 | 担当者 4 | 1. | ||
| 5日目 | 2. | 1. | ||
| 6日目 | 担当者 3 | 2. | ||
| 7日目 | 担当者 4 | 担当者 3 | ||
| 8日目 | 担当者 4 | |||
| 9日目 | ビデオデータの分析と統計(ステップ8) | |||
| 担当者 = 繰り返し |
表 2: 学習時間、トレーニング時間、およびテスト時間(学習時間、STM、LTM)
| 学習 | STM | LTM | |
| トレーニング時間 | 1 h. | 1 h. | 8時間。 |
| 休息時間 | 0 時間。 | 1 h. | 〜24時間。 |
| トレーニングを開始する | 0 h. アロ | 0 h. アロ | 4 時間. ブロ |
| トレーニングを停止する | 1 時間. アロ | 1 時間. アロ | 4 時間. アロ |
| テストを開始する | 1 時間. アロ | 2 時間. アロ | 0 h. アロ (翌日) |
| ALO = ライトが点灯した後、BLO = ライトが点灯する前、STM = 短期記憶、LTM = 長期記憶 | |||
表3:アナ学習スクリプトから作成された統計データ
analearn スクリプトから生成された統計データ。遺伝子型を含むブートストラップR-スクリプトの出力ファイル(すなわち、学習条件、STM、LTM)は、CIナイーブ、平均CI訓練、LI、実験条件と比較した制御のLI間の差(LIdif)、LIdifの95%信頼区間の下限(LL)および上限(UL)の間の差を意味し 、p値は有意差がないことを示す。
| 遺伝子型 | 学習 | CI | CI | 李 | 李 | 下限 | 上限 | p値 |
| 条件 | 甘い | 訓練 | 差 | (95% の打ち合せ間隔) | (95% の打ち合せ間隔) | |||
| コントロール | STM | 0.467 | 0.116 | 0.752 | NA | NA | NA | NA |
| ダップ アット RNAi | STM | 0.699 | 0.257 | 0.633 | 0.119 | -0.03 | 0.265 | 0.116 |
| コントロール | LTM | 0.59 | 0.384 | 0.348 | NA | NA | NA | NA |
| ダップ アット RNAi | LTM | 0.697 | 0.65 | 0.068 | 0.28 | 0.103 | 0.446 | 0.003 |
補足ファイルS1:求愛室の建築計画。 ファイルは、.stp 拡張子 (CAD ファイル) を許可する任意のアプリケーションで開くことができます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル S2: Analearn スクリプトの入力ファイルの例。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル S3: Analearn.R スクリプト. ファイルはR-studioで開くことができます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| P{KK101437}VIE-260B | VDRC | 101437 | Dhat-at-RNAi in 60100 background |
| P{KK108109}VIE-260B | - | - | Control-RNAi in 60100 background (gift from K. Keleman) |
| w+, UAS-dcr2/yhh;;elav-Gal4 (III) | - | - | panneuronal driver line |
| Containers for plant tissue culture | VWR | 960177 | 175 mL plastic vials |
| Folded filters | Whatman | 10311643 | Filter paper to enlarge area flies can pupate on |
| Flat-bottom blocks (96-wells) | Qiagen | 19579 | Used for housing blocks |
| MicroAmp Clear Adhesive Film | Applied Biosystems | 4306311 | PCR adhesive film as lid on flat-bottom blocks |
| Razor blade | - | - | Any sharp will do |
| Needle | - | - | 0.8 mm diameter |
| Aspirator | - | - | Cut a 1mL pipet tip with scissors in order to have two pieces. The narrow tip of the pipettip is placed as fly entrance in a ~80 cm flexible hose. To prevent a fly from getting in the hose, a normal piece of cotton or small mesh gaze is placed in between the tip and the hose. The other half of the pipettip can be used as mouth piece at the end of the hose. |
| Courtship chambers | - | - | file S1 can be opened with indicated CAD software |
| Camcorder | Sony | - | camera specification: >4M pixels, full HD. |
| For manual quantification, any simple video recording device has the potential to produce a video of sufficient quality to observe courtship behavior accurately. For automated quantification, there will likely be different requirements depending on the software to be used, and users should investigate this thoroughly if automated quantification is desired. | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| power food | |||
| Agar | Sigma | A7002 | |
| Yeast | Bruggeman | - | |
| Yeast extract | MP biomedicals | 0210330391 | |
| Peptone | Sigma | P6838 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| CaCl2 | Merck | 1023780500 | |
| Methylparabene (CAUTION) | Sigma | H5501 | |
| Propionic acid (CAUTION) | Sigma | P1386 | |
| Demineralized water | - | ||
| Yeast paste | - | yeast grains and water mixture in a 1:1 ratio | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| normal food | |||
| Agar | MP biomedicals | 215017890 | |
| Yeast | bruggeman | - | |
| Corn flour | de Molen | - | |
| Sugar | de Molen | - | |
| Methylparabene (CAUTION) | Sigma | H5501 | |
| Propionic acid (CAUTION) | Sigma | P1386 | |
| Demineralized water | - | ||
