Essiccazione chimica: Preparazione biologica del campione per la microscopia elettronica a scansione (SEM)

Overview

La microscopia elettronica a scansione (SEM) è un potente strumento per l'immagine, principalmente, delle caratteristiche superficiali di un campione biologico. Una corretta preparazione del campione, tuttavia, è fondamentale per ottenere immagini di qualità. Questo video si concentra sulle fasi di disidratazione e asciugatura della preparazione della Drosophila adulta intatta per SEM.

Protocol

Questo protocollo è un estratto da Koon et al.,Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM), J. Vis. Exp.

1. Preparazione e fissazione

1. Preparare Drosophila melanogaster (mosca della frutta).
   1. Anestetizza le mosche adulte usando anidride carbonica al 100%. Posizionare gli adulti anestetizzati (da 10 a 30 mosche) in una piccola fiala a vite di plastica o in un tubo di centrifuga da 1,5 ml.
   2. Immergere le mosche anestetizzate in 1 mL di fissivo (1,25% glutaraldeide, 0,1 M tampone fosfato pH 7,2) per 2 h (o durante la notte) a 4 °C. Se le mosche galleggiano sulla superficie del fissatore, aggiungere alcune gocce del 2,5% di polietilene glicole tert-ottilfenil etere per indebolire la tensione superficiale del fissatore consentendo l'immersione totale del tessuto. Rimuovere il fissatore utilizzando una pipetta di vetro.

2. Lavaggio e disidratazione

1. Lavare e disidratare Drosophila melanogaster (mosca della frutta).
   1. Lavare il campione fisso tre volte con 1 ml di tampone fosfato da 0,1 M pH 7,2 a temperatura ambiente per 10 minuti in un tubo di microcentrifugo da 1,5 ml. Rimuovere ogni lavaggio con una pipetta di vetro, facendo attenzione a non rimuovere le mosche.
   2. Disidratare il campione utilizzando una serie di etanolo graduato, per 10 minuti in un volume di 1 ml in un tubo di microfugo. Le concentrazioni di etanolo sono: 25%, 50%, 75%, 80%, 95%, 100%. Rimuovere l'etanolo con una pipetta di vetro, facendo attenzione a non rimuovere le mosche.
   3. Conservare il campione nel tubo di microcentrifugo da 1,5 ml con appena il 100% di etanolo sufficiente per coprire il campione prima dell'essiccazione.

3. Essiccazione

1. Eseguire l'essiccazione chimica utilizzando esametildisilazane (HMDS).
   1. Sostituire la soluzione al 100% di etanolo con una soluzione 1:2 di HMDS e 100% di etanolo per 20 min. Sostituire la soluzione 1:2 con una soluzione 2:1 di HMDS e 100% di etanolo per 20 min. Sostituire la soluzione 2:1 con HMDS al 100% per 20 min. Ripetere una volta.
      Nota: l'HMDS è infiammabile e una tossina acuta (via dermica). L'HMDS deve essere maneggiato in una cappa chimica utilizzando dispositivi di protezione individuale appropriati, tra cui guanti, camice da laboratorio e protezione degli occhi.
   2. Trasferire il campione in HMDS, se in un tubo di microcentrifugo da 1,5 ml, in un piatto monouso di pesatura in alluminio. Una volta nel piatto di pesatura in alluminio, sostituire l'HMDS al 100% con un HMDS fresco appena sufficiente al 100% per coprire il campione.
   3. Trasferire il campione in un essiccatore di plastica o vetro non sottovuoto con essiccante fresco (5-6 cm di profondità) e posizionare in una cappa chimica dei fumi. In alternativa, posizionare il campione direttamente in una cappa chimica per asciugare con un coperchio sciolto, come una scatola, per evitare che i detriti cadano sul campione. Lasciare asciugare il campione per 12-24 ore.

4. Montaggio

1. Monte Drosophila melanogaster (mosca della frutta).
   1. Etichettare la parte inferiore dello stub di montaggio in alluminio per indicare ciò che viene posizionato sopra.
      Posizionare le mosche essiccate nella posizione desiderata sulla linguetta adesiva o adesiva in carbonio fissata sulla parte superiore di uno stub sotto un microscopio sezionante con pinzette di precisione.
   2. Applicare adesivo conduttivo argento, cioèvernice argentata, attorno ai bordi esterni degli stub. Collega la vernice argentata alle mosche usando uno stuzzicadenti per garantire la conducibilità. Non lasciare che la vernice tocchi l'area di imaging desiderata.
   3. Posizionare gli stub in una scatola portatubi e posizionare la scatola portatubi aperta in un essiccatore. Lasciare asciugare la vernice argentata almeno 3 ore o durante la notte per ottenere i migliori risultati.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silver conductive adhesive 503	Electron Microscopy Sciences	12686-15
aluminum weighing dish	Fisher Scientific	08-732-100
aluminum mounting stubs (12 mm)	Electron Microscopy Sciences	75210
aluminum mounting stubs (25 mm)	Electron Microscopy Sciences	75186
Adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	76760
conductive carbon adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	77825
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100)	VWR	97062-208
Hitachi 3400N-II SEM	Hitachi	https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/	The company doesn't appear to sell this model any longer