Secado químico: Preparación de muestras biológicas para microscopía electrónica de barrido (SEM)

Overview

La microscopía electrónica de barrido (SEM) es una poderosa herramienta para crear imágenes, principalmente, de las características superficiales de una muestra biológica. La preparación adecuada de la muestra, sin embargo, es fundamental para obtener imágenes de calidad. Este video se centra en los pasos de deshidratación y secado de la preparación de Drosophila adulta intacta para sem.

Protocol

Este protocolo es un extracto de Koon et al., Preparación de organismos prokaryoticos y eucariotas utilizando secado químico para el análisis morfológico en microscopía electrónica de barrido (SEM), J. Vis. Exp. (2019).

1. Preparación y fijación

1. Preparar Drosophila melanogaster (mosca de la fruta).
   1. Anestesia las moscas adultas usando dióxido de carbono al 100%. Coloque adultos anestesiados (alrededor de 10 a 30 moscas) en un pequeño vial de tapa de tornillo de plástico o tubo centrífuga de 1,5 ml.
   2. Sumerja las moscas anestesiadas en 1 ml de fijador (1,25% glutaraldehído, 0,1 M tampón de fosfato pH 7,2) durante 2 h (o durante la noche) a 4 °C. Si las moscas flotan en la superficie del fijador, agregue unas gotas de éter de polietilenoglicol tert-octilfenilo para debilitar la tensión superficial del fijador permitiendo la inmersión total del tejido. Retire el fijador con un pipete de vidrio.

2. Lavado y deshidratación

1. Lave y deshidrate Drosophila melanogaster (mosca de la fruta).
   1. Lave la muestra fija tres veces con 1 ml de 0,1 M de tampón de fosfato pH 7,2 a temperatura ambiente durante 10 minutos en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Retire cada lavado con una pipeta de vidrio, teniendo cuidado de no quitar las moscas.
   2. Deshidratar la muestra utilizando una serie de etanol calificado, durante 10 minutos en un volumen de 1 ml en un tubo de microcombustible. Las concentraciones de etanol son: 25%, 50%, 75%, 80%, 95%, 100%. Retire el etanol con una pipeta de vidrio, teniendo cuidado de no quitar las moscas.
   3. Conservar la muestra en el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con suficiente etanol al 100% para cubrir la muestra antes de secar.

3. Secado

1. Realizar el secado químico utilizando hexametildisilazane (HMDS).
   1. Reemplace la solución de etanol 100% por una solución de 1:2 de HMDS y 100% etanol durante 20 min. Reemplace la solución 1:2 por una solución 2:1 de HMDS y 100% etanol durante 20 min. Reemplace la solución 2:1 por 100% HMDS durante 20 min. Repita una vez.
      Nota: HMDS es inflamable y una toxina aguda (ruta dérmica). El HMDS debe manipularse en una campana química con equipos de protección personal adecuados, incluidos guantes, bata de laboratorio y protección ocular.
   2. Transfiera la muestra en HMDS, si está en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, a un plato de pesaje de aluminio desechable. Una vez en el plato de pesaje de aluminio, reemplace el 100% HMDS por suficiente HMDS fresco para cubrir la muestra.
   3. Transfiera la muestra a un desecador de plástico o vidrio sin vacío con desecante fresco (5-6 cm de profundidad) y colóquela en una campana química de humo. Alternativamente, coloque la muestra directamente en una campana química para secar con una tapa suelta, como una caja, para evitar que los desechos caigan sobre la muestra. Deje que la muestra se seque de 12 a 24 h.

4. Montaje

1. Monte Drosophila melanogaster (mosca de la fruta).
   1. Etiquete la parte inferior del talón de montaje de aluminio para indicar lo que se está colocando en la parte superior.
      Coloque las moscas secas en la posición deseada en la lengüeta adhesiva o adhesiva de carbono asegurada en la parte superior de un talón bajo un microscopio diseccionador con pinzas de precisión.
   2. Aplicar adhesivo conductor de plata, es decir,pintura plateada, alrededor de los bordes exteriores de los talones. Conecte la pintura plateada a las moscas usando un palillo de dientes para garantizar la conductividad. No permita que la pintura toque el área de imágenes deseada.
   3. Coloque los talones en una caja de soporte de talón y coloque la caja del soporte del talón abierto en un desecador. Deje que la pintura plateada se seque al menos 3 h o durante la noche para obtener los mejores resultados.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silver conductive adhesive 503	Electron Microscopy Sciences	12686-15
aluminum weighing dish	Fisher Scientific	08-732-100
aluminum mounting stubs (12 mm)	Electron Microscopy Sciences	75210
aluminum mounting stubs (25 mm)	Electron Microscopy Sciences	75186
Adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	76760
conductive carbon adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	77825
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100)	VWR	97062-208
Hitachi 3400N-II SEM	Hitachi	https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/	The company doesn't appear to sell this model any longer