Séchage chimique : Préparation d’échantillons biologiques pour la microscopie électronique à balayage (SEM)

Overview

La microscopie électronique à balayage (SEM) est un outil puissant pour imager , principalement, les caractéristiques de surface d’un échantillon biologique. Toutefois, une bonne préparation de l’échantillon est essentielle à l’obtention d’images de qualité. Cette vidéo se concentre sur les étapes de déshydratation et de séchage de la préparation intacte drosophile adulte pour SEM.

Protocol

Ce protocole est un extrait de Koon et coll.,Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM), J. Vis. Exp. (2019).

1. Préparation et fixation

1. Préparer Drosophila melanogaster (mouche des fruits).
   1. Anesthésier les mouches adultes à l’aide de dioxyde de carbone à 100 %. Placer les adultes anesthésiés (environ 10 à 30 mouches) dans un petit flacon de bouchon à vis en plastique ou un tube de centrifugeuse de 1,5 mL.
   2. Immerger les mouches anesthésiées dans 1 mL de fixatif (1,25% de glutaraldehyde, 0,1 M de phosphate tampon pH 7,2) pendant 2 h (ou toute la nuit) à 4 °C. Si les mouches flottent à la surface du fixatif, ajouter quelques gouttes de 2,5% d’éther de polyéthylène glycol tert-octylphényle pour affaiblir la tension de surface du fixatif permettant une submersion totale du tissu. Retirer le fixatif à l’aide d’un pipet en verre.

2. Lavage et déshydratation

1. Laver et déshydrater le Drosophila melanogaster (mouche des fruits).
   1. Laver l’échantillon fixe trois fois avec 1 mL de 0,1 M de pH tampon phosphate 7,2 à température ambiante pendant 10 min dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL. Retirez chaque lavage avec une pipette en verre, en prenant soin de ne pas enlever les mouches.
   2. Déshydrater l’échantillon à l’aide d’une série d’éthanol classé, pendant 10 min dans un volume de 1 mL dans un tube de microfuge. Les concentrations d’éthanol sont les suivante : 25 %, 50 %, 75 %, 80 %, 95 %, 100 %. Retirez l’éthanol à l’eau d’une pipette en verre, en prenant soin de ne pas enlever les mouches.
   3. Conserver l’échantillon dans le tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL avec juste assez d’éthanol à 100 % pour couvrir l’échantillon avant le séchage.

3. Séchage

1. Effectuer le séchage chimique à l’aide d’hexaméthyldisilazane (HMDS).
   1. Remplacez la solution 100% éthanol par une solution 1:2 de SMDS et 100% d’éthanol pendant 20 min. Remplacez la solution 1:2 par une solution 2:1 de SMD et 100 % d’éthanol pendant 20 min. Remplacez la solution 2:1 par 100% HMDS pendant 20 min. Répétez une fois.
      Note: HMDS est inflammable et une toxine aiguë (voie cutanée). Le SMDS doit être manipulé dans une hotte chimique à l’aide d’équipement de protection individuelle approprié, y compris des gants, un manteau de laboratoire et une protection oculaire.
   2. Transférer l’échantillon dans HMDS, si dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL, dans un plat de pesage en aluminium jetable. Une fois dans le plat de pesage en aluminium, remplacer le 100% HMDS par juste assez frais 100% HMDS pour couvrir l’échantillon.
   3. Transférer l’échantillon dans un dessiccateur en plastique ou en verre sans vide avec un desiccant frais (5-6 cm de profondeur) et le placer dans un capot chimique. Alternativement, placez l’échantillon directement dans un capot chimique de vapeur pour sécher avec un couvercle lâche, tel qu’une boîte, pour empêcher des débris de tomber sur l’échantillon. Laisser sécher l’échantillon de 12 à 24 h.

4. Montage

1. Mont Drosophila melanogaster (mouche des fruits).
   1. Étiquetez le fond du talon de montage en aluminium pour indiquer ce qui est placé sur le dessus.
      Placez les mouches séchées dans la position désirée sur un onglet adhésif ou adhésif en carbone fixé au sommet d’un talon sous un microscope disséquant avec des pinces de précision.
   2. Appliquer de l’adhésif conductrice argenté, c’est-à-direde la peinture argentée, sur les bords extérieurs des talons. Connectez la peinture argentée aux mouches à l’aide d’un cure-dent pour assurer la conductivité. Ne laissez pas la peinture toucher la zone d’imagerie désirée.
   3. Placez les talons dans une boîte de support de talon et placez la boîte ouverte de support de talon dans un desiccator. Laissez sécher la peinture argentée au moins 3 h ou toute la nuit pour obtenir de meilleurs résultats.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silver conductive adhesive 503	Electron Microscopy Sciences	12686-15
aluminum weighing dish	Fisher Scientific	08-732-100
aluminum mounting stubs (12 mm)	Electron Microscopy Sciences	75210
aluminum mounting stubs (25 mm)	Electron Microscopy Sciences	75186
Adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	76760
conductive carbon adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	77825
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100)	VWR	97062-208
Hitachi 3400N-II SEM	Hitachi	https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/	The company doesn't appear to sell this model any longer