Secagem Química: Preparação biológica da amostra para microscopia eletrônica de varredura (SEM)

Overview

A microscopia eletrônica de varredura (SEM) é uma ferramenta poderosa para a imagem — principalmente — as características da superfície de uma amostra biológica. A preparação adequada da amostra, no entanto, é fundamental para a obtenção de imagens de qualidade. Este vídeo foca nas etapas de desidratação e secagem da preparação de Drosophila adulto intacto para SEM.

Protocol

Este protocolo é um trecho de Koon et al., Preparação de Organismos Procarióticos e Eucarióticos Utilizando Secagem Química para Análise Morfológica em Microscopia Eletrônica de Varredura (SEM), J. Vis. Exp. (2019).

1. Preparação e Fixação

1. Prepare Drosophila melanogaster (mosca-das-frutas).
   1. Anesthetize moscas adultas usando 100% dióxido de carbono. Coloque adultos anestesiados (cerca de 10 a 30 moscas) em um pequeno frasco de tampa de rosca de plástico ou tubo de centrífuga de 1,5 mL.
   2. Mergulhe moscas anestesiadas em 1 mL de fixação (1,25% glutaraldeído, 0,1 M tampão fosfato pH 7.2) por 2h (ou durante a noite) a 4 °C. Se as moscas flutuarem para a superfície do fixador, adicione algumas gotas de 2,5% de polietileno glicol tert-octilfenil ether para enfraquecer a tensão superficial do fixador permitindo a submersão total do tecido. Remova o fixador usando uma tubulação de vidro.

2. Lavagem e Desidratação

1. Lave e desidratar Drosophila melanogaster (mosca-das-frutas).
   1. Lave a amostra fixa três vezes com 1 mL de 0,1 M de tampão fosfato pH 7,2 em temperatura ambiente por 10 minutos em um tubo de microcentrifutura de 1,5 mL. Remova cada lavagem com uma pipeta de vidro, tomando cuidado para não remover as moscas.
   2. Desidratar a amostra utilizando uma série de etanol de grau, por 10 minutos em um volume de 1 mL em um tubo de microfuge. As concentrações de etanol são: 25%, 50%, 75%, 80%, 95%, 100%. Retire o etanol com uma pipeta de vidro, tomando cuidado para não remover as moscas.
   3. Retenha a amostra no tubo de microcentrifutura de 1,5 mL com apenas 100% de etanol suficiente para cobrir a amostra antes da secagem.

3. Secagem

1. Realizar secagem química utilizando hexametiletiladisilazane (HMDS).
   1. Substitua a solução 100% etanol por uma solução 1:2 de HMDS e 100% etanol por 20 min. Substitua a solução 1:2 por uma solução 2:1 de HMDS e 100% etanol por 20 min. Substitua a solução 2:1 por 100% HMDS por 20 minutos. Repita uma vez.
      Nota: O HMDS é inflamável e uma toxina aguda (rota dérmica). O HMDS deve ser manuseado em um capô de fumaça química usando equipamentos de proteção pessoal apropriados, incluindo luvas, jaleco e proteção ocular.
   2. Transfira a amostra em HMDS, se em um tubo de microcentrifus de 1,5 mL, em um prato de pesagem de alumínio descartável. Uma vez no prato de pesagem de alumínio, substitua o HMDS 100% por apenas 100% HMDS fresco suficiente para cobrir a amostra.
   3. Transfira a amostra para um dessecador plástico ou de vidro não-vácuo com dessecante fresco (5-6 cm de profundidade) e coloque em uma capa de fumaça química. Alternativamente, coloque a amostra diretamente em um capô de fumaça química para secar com uma tampa solta, como uma caixa, para evitar que os detritos caiam sobre a amostra. Deixe a amostra secar por 12 a 24 horas.

4. Montagem

1. Monte Drosophila melanogaster (mosca-das-frutas).
   1. Rotule a parte inferior da montagem de alumínio para indicar o que está sendo colocado em cima.
      Coloque as moscas secas na posição desejada na aba adesivo ou de adesão de carbono presa ao topo de um stub sob um microscópio dissecando com pinças de precisão.
   2. Aplique adesivo condutor de prata, ou seja,tinta prateada, ao redor das bordas externas dos stubs. Conecte a tinta prateada às moscas usando um palito para garantir a condutividade. Não permita que a tinta toque na área de imagem desejada.
   3. Coloque os stubs em uma caixa de suporte de stub e coloque a caixa aberta em um desiccator. Deixe a tinta prateada secar pelo menos 3h ou durante a noite para obter melhores resultados.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silver conductive adhesive 503	Electron Microscopy Sciences	12686-15
aluminum weighing dish	Fisher Scientific	08-732-100
aluminum mounting stubs (12 mm)	Electron Microscopy Sciences	75210
aluminum mounting stubs (25 mm)	Electron Microscopy Sciences	75186
Adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	76760
conductive carbon adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	77825
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100)	VWR	97062-208
Hitachi 3400N-II SEM	Hitachi	https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/	The company doesn't appear to sell this model any longer