Kimyasal Kurutma: Tarama Elektron Mikroskopisi (SEM) için Biyolojik Numune Hazırlama

Overview

Taramalı elektron mikroskopisi (SEM), öncelikle biyolojik bir numunenin yüzey özelliklerini görüntüleyen güçlü bir araçtır. Bununla birlikte, uygun numune hazırlama, kaliteli görüntüler elde etmek için kritik öneme sahiptir. Bu video, SEM için sağlam yetişkin Drosophila hazırlamanın dehidrasyon ve kurutma adımlarına odaklanıyor.

Protocol

Bu protokol, Koon ve ark.Tarama Elektron Mikroskopisinde (SEM), J. Vis. Exp. (2019) Morfolojik Analiz için Kimyasal Kurutma Kullanan Prokaryotik ve Ökaryotik Organizmaların Hazırlanması'ndan bir alıntıdır.

1. Hazırlık ve Fiksasyon

1. Drosophila melanogaster (meyve sineği) hazırlayın.
   1. Yetişkin sinekleri% 100 karbondioksit kullanarak uyuşturmak. Uyuşturulmuş yetişkinleri (yaklaşık 10 ila 30 sinek) küçük bir plastik vida kapağı şişesine veya 1,5 mL santrifüj tüpüne yerleştirin.
   2. Uyuşturulduğu sinekleri 4 °C'de 2 saat (veya geceleme) için 1 mL fiksatif (%1,25 glutaraldehit, 0,1 M fosfat tampon pH 7,2) içine daldır. Sinekler fiksatifin yüzeyine yüzerse, dokunun toplam batırılmasına izin vererek fiksatifin yüzey gerilimini zayıflatmak için% 2.5 polietilen glikol tert-o sekizilfenil eterden birkaç damla ekleyin. Bir cam pipet kullanarak fiksatifi çıkarın.

2. Yıkama ve Dehidrasyon

1. Drosophila melanogaster'ı (meyve sineği) yıkayın ve susuzlaştır.
   1. Sabit numuneyi oda sıcaklığında 1 mL 0,1 M fosfat tampon pH 7,2 ile 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde 10 dakika boyunca üç kez yıkayın. Sinekleri çıkarmamaya dikkat ingerek her yıkamayı bir cam pipetle çıkarın.
   2. Numuneyi, bir mikrofuge tüpünde 1 mL hacimde 10 dakika boyunca dereceli bir etanol serisi kullanarak susuzlur. Etanol konsantrasyonları şunlardır: %25, %50, %75, %80, %95, %100. Etanolleri bir cam pipetle çıkarın, sinekleri çıkarmamaya dikkat edin.
   3. Numuneyi 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde kurumadan önce numuneyi kaplayacak kadar% 100 etanol ile saklayın.

3. Kurutma

1. Hexamethyldisilazane (HMDS) kullanarak kimyasal kurutma gerçekleştirin.
   1. % 100 etanol çözeltisini 1:2 HMDS çözeltisi ve 20 dakika boyunca% 100 etanol ile değiştirin. 1:2 çözeltisini 2:1 HMDS çözeltisi ve 20 dakika boyunca% 100 etanol ile değiştirin. 2:1 çözeltisini 20 dakika boyunca %100 HMDS ile değiştirin.
      Not: HMDS yanıcıdır ve akut bir toksindir (dermal yol). HMDS, eldiven, laboratuvar önlüğü ve göz koruması dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman kullanılarak kimyasal duman kaputunda ele alınmalıdır.
   2. Numuneyi HMDS'de, 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde ise, tek kullanımlık bir alüminyum tartım kabına aktarın. Alüminyum tartım kabına girdikten sonra, %100 HMDS'yi numuneyi kaplayacak kadar taze %100 HMDS ile değiştirin.
   3. Numuneyi taze kurutuculu (5-6 cm derinliğinde) plastik veya cam vakumsuz bir kurutucuya aktarın ve kimyasal bir duman davlumbazına yerleştirin. Alternatif olarak, numunenin üzerine döküntü düşmesini önlemek için numuneyi kutu gibi gevşek bir kapakla kurutmak için doğrudan kimyasal bir duman kaputuna yerleştirin. Numunenin 12 ila 24 saat kurumasını bekleyin.

4. Montaj

1. Drosophila Dağı melanogaster (meyve sineği).
   1. Üzerine ne yerleştirildiğini belirtmek için alüminyum montaj saplamanın altını etiketle.
      Kurutulmuş sinekleri hassas cımbızla bir diseksiyon mikroskobu altında bir saplamanın üstüne sabitlenmiş yapışkan veya karbon yapışkan sekmesine istediğiniz konuma yerleştirin.
   2. Koçanların dış kenarlarına gümüş iletken yapıştırıcı, yanigümüş boya uygulayın. İletkenliği sağlamak için gümüş boyayı bir kürdan kullanarak sineklere bağlayın. Boyanın istenen görüntüleme alanına dokunmasına izin vermeyin.
   3. Saplamaları bir saplama tutucu kutusuna yerleştirin ve açık saplama tutucu kutusunu bir kurutucuya yerleştirin. En iyi sonuçlar için gümüş boyanın en az 3 saat veya gece boyunca kurumasına izin verin.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silver conductive adhesive 503	Electron Microscopy Sciences	12686-15
aluminum weighing dish	Fisher Scientific	08-732-100
aluminum mounting stubs (12 mm)	Electron Microscopy Sciences	75210
aluminum mounting stubs (25 mm)	Electron Microscopy Sciences	75186
Adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	76760
conductive carbon adhesive tabs	Electron Microscopy Sciences	77825
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100)	VWR	97062-208
Hitachi 3400N-II SEM	Hitachi	https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/	The company doesn't appear to sell this model any longer