تضمين الكبار دروسوفيلا رؤساء في البارافين: إعداد الأنسجة لعلم الأنسجة

Overview

يصف هذا الفيديو كيفية تضمين رؤوس Drosophila في البارافين باستخدام طريقة الياقات البيضاء ، وهي تقنية تعد رؤوس الذباب للتقسم التسلسلي. وتستخدم أقسام البارافين للفحوصات النسيجية لتشريح الدماغ وتقييم التنكس العصبي. يوضح البروتوكول المميز كيف يمكن معالجة الذباب المتعدد في إعداد واحد ، وبالتالي زيادة كفاءة الوقت وتقليل القطع الأثرية التجريبية.

Protocol

هذا البروتوكول هو مقتطف من Sunderhaus و Kretzschmar, Mass Histology لقياس التنكس العصبي في Drosophila, J. Vis. Exp. (2016).

1. تحديد الرأس على الياقات والتضمين في البارافين

ملاحظة: وينبغي أن يتم كل الخطوات في عملية التثبيت في غطاء الدخان. ميثيلبنزوات، في حين لا تشكل خطرا على الصحة، لديه رائحة متميزة للغاية، والتي يمكن أن تكون ساحقة إذا لم يتم التعامل معها في غطاء الدخان.

1. قبل تخدير الذباب، تشكل 50 مل من محلول كارنوي بإضافة 15 مل من الكلوروفورم و 5 مل من حمض الخليك الجليدي إلى 30 مل من الإيثانول بنسبة 99٪ (لا تخلط الكلوروفورم وحمض الخليك). صب في وعاء زجاجي مع أسفل شقة، مثل طبق تبلور، لضمان أن الياقات يمكن أن تضع شقة وتغطي تماما من قبل الحل.
2. تخدير الذباب مع ثاني أكسيد الكربون_أو الأثير.
3. يطير الخيط (حتى 20 مع معظم الياقات) من أعناقهم في الياقات باستخدام ملقط. تذكر محاذاة جميع الرؤوس في نفس الاتجاه، كما رأينا في الشكل 1A،وكن لطيفا لضمان عدم حدوث أي ضرر في الرأس أو العينين.
4. وتشمل الذباب جيب oculis (السهام، الشكل 1A)في مواقع عشوائية بحيث يمكن التعرف على ترتيب الذباب بسهولة في المقاطع. بالإضافة إلى ذلك ، إذا كان الذباب التجريبي له لون عين فاتح أو أبيض ، قم بخيط بعض الذباب الأحمر العينين ، مثل النوع البري ، بينهما لضمان وجود صبغة كافية لتلطيخ الشريحة. تسجيل ترتيب الذباب على ورقة بروتوكول جنبا إلى جنب مع رقم طوق إذا باستخدام أكثر من طوق واحد.
5. وبمجرد الانتهاء من طوق، وضعه في حل كارنوي المعدة لمدة 3.5 - 4 ساعة.
6. تفريغ محلول Carnoy في علبة التخلص المناسبة وتبدأ يغسل الإيثانول. تأكد من صب ببطء حتى لا تعكر صفو وضع الياقات في الحاوية.
7. غسل الياقات لمدة 30 دقيقة في الإيثانول 99٪ مرتين.
8. غسل الياقات في الإيثانول 100٪ لمدة 1 ساعة. تأكد من تغيير يغسل في الوقت المحدد لمنع الإماهة الزائدة.
9. وضع الياقات في ميثيل بنزوات O / N في RT. ختم الحاوية مع البارافيلم لمنع تبخر ميثيل بنزوات.
10. صب ميثيلبينوزات في الحاوية المناسبة المتاح في غطاء الدخان. أضف خليطا تم إعداده مسبقا من 1:1 نقطة انصهار منخفضة (56 - 57 درجة مئوية) شمع البارافين والميثيلبينزوات. من هذه النقطة فصاعدا، يجب أن تبقى الياقات في حاضنة عند 65 درجة مئوية للتأكد من أن البارافين لا تصلب.
11. صب خليط ميثيلبينوزات وبارافين في الحاوية المناسبة المتاح، وصب شمع البارافين النقي المنصهر، أبقى في 65 درجة مئوية، على الياقات.
12. تغيير البارافين بعد 30 دقيقة وتكرار ذلك على الأقل 5 مرات. وينبغي إجراء ما لا يقل عن 6-8 يغسل.
13. وبمجرد الانتهاء من يغسل، وضع الياقات في علبة مكعبات الثلج المطاط مع فتحات تقريبا حجم الياقات. صب البارافين المنصهر عليها حتى مغطاة بالكامل والسماح لها لتصلب O / N (في محاولة لتجنب فقاعات الهواء).
14. إزالة كتل البارافين التي تحتوي على الياقات من علبة مكعب الثلج. فصل كتلة البارافين من ذوي الياقات البيضاء باستخدام شفرة حلاقة، وكسر بلطف قبالة طوق. الرؤوس ستكون في كتلة البارافين بينما الجثث ستبقى في الطوق يمكن الاحتفاظ بالكتل في درجة حرارة الغرفة.
15. لتنظيف الياقات، نقع لهم في عامل إزالة اليبارافين في 65 درجة مئوية لإزالة البارافين، نظيفة مع تنقية الضوء، ويغسل في الإيثانول قبل إعادة استخدامها.

Representative Results

الشكل 1: أقسام المسلسل البارافين. أ) باستخدام طريقة طوق، يمكن معالجة الذباب التجريبية والتحكم كعينة واحدة عن طريق خيوط لهم على طوق واحد. يتم إدراج الذباب جيب العينين oculis للتوجيه (السهام). ب) التخطيطي تبين اتجاه رؤوس ذبابة في ذوي الياقات البيضاء. ج) في هذه الصورة، يتم توجيه أقسام من رؤساء ذبابة مختلفة من اليسار إلى اليمين على الشريحة. من أعلى إلى أسفل على الشريحة، يمكن رؤية المقاطع التسلسلية من نفس رأس الذبابة. في هذه الحالة، تم إدراج ذبابة جيبية oculis في الموضع الثالث (السهم). وتلطخ الأقسام من قبل صبغة العين الفلورية التي تغسل على الأقسام بعد القطع. شريط المقياس في A = 5 مم وفي C = 0.5 مم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collar	Genesee Scientific	TS 48-100	We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee.
Rubber ice cube tray for embedding	Household store		The size can be made-to-fit by glueing in additional walls
Crystallizing dish	Fisher Scientific Company	08-762-3
Ether	Fisher Scientific Company	E138-1
Ethanol	Decon Laboratories Inc.	2701
Choloroform	Fisher Scientific Company	C298-500
Glacial Acetic Acid	Fisher Scientific Company	A38-212
Methylbenzoate	Fisher Scientific Company	M205-500	Distinct Odor - Use in fume hood!
Low Melting Point Paraffin Wax	Fisher Scientific Company	T565	Make sure to keep extra melted in a 65 °C waterbath