Overview
이 비디오는 드로소필라 머리를 파라핀에 포함시키는 방법을 설명하며, 이는 직렬 단면을 위해 날아다니는 머리를 준비하는 기술입니다. 파라핀 섹션은 뇌의 해부학및 신경 변성의 평가를 위해 조직학적 검사에 사용됩니다. 이 프로토콜은 한 번의 준비에서 여러 개의 파리를 처리하는 방법을 보여 주므로 시간 효율성을 높이고 실험 아티팩트를 최소화합니다.
Protocol
이 프로토콜은 Sunderhaus와 크레츠슈마르에서발췌, 드로소필라에서신경 변성을 정량화하는 질량 히스토리, J. Vis. Exp. (2016).
1. 파라핀에 머리를 고정하고 칼라에 포함
참고: 고정 프로세스의 모든 단계는 연기 후드에서 수행해야합니다. 메틸벤조아테는 건강상의 위험을 초래하지 는 않지만 연기 후드에서 다루지 않으면 압도적 일 수있는 매우 뚜렷한 냄새가 납니다.
- 파리를 마취하기 전에, 클로로폼 15mL및 빙하 아세트산 5mL을 30mL에 99%에 탄올(클로로폼과 아세트산을 혼합하지 않음)을 첨가하여 50mL의 카노이 용액을 구성한다. 결정화 접시와 같은 평평한 바닥이있는 유리 용기에 부어 칼라가 평평하게 누워 용액에 완전히 덮여 있는지 확인합니다.
- CO2 또는 에테르로 파리를 마취합니다.
- 실은 집게를 사용하여 목에 의해 (대부분의 칼라가있는 최대 20 개까지) 날아갑니다. 그림 1 A에서볼 수 있듯이 모든 머리를 동일한 방향으로 정렬하고 머리나 눈에 손상이 발생하지 않도록 부드럽게 해야 합니다.
- 시오큘리스 파리(화살표, 그림 1A)를임의의 위치에 포함시켜 플라이의 순서를 섹션에서 쉽게 식별할 수 있도록 한다. 또한 실험용 파리에 밝은 눈색깔이 있는 경우, 야생형과 같은 일부 적눈 파리를 나사로 연결하여 슬라이드를 얼룩지게 하기에 충분한 안료가 존재하도록 합니다. 하나 이상의 칼라를 사용하는 경우 칼라 번호와 함께 프로토콜 시트에 파리의 순서를 기록합니다.
- 칼라가 완성되면 3.5 - 4 시간 동안 준비 된 카노이 솔루션에 놓습니다.
- 카노이 용액을 적절한 폐기 캐니스터에 버리고 에탄올 세차스를 시작합니다. 용기에 칼라의 배치를 방해하지 않도록 천천히 부어 있는지 확인하십시오.
- 칼라를 99% 에탄올로 2회 30분 세척합니다.
- 칼라를 100% 에탄올로 1시간 세척합니다. 과탈수 방지하려면 제 시간에 세서를 변경해야합니다.
- RT에서 메틸벤조아테 O/N에 칼라를 넣으세요.
- 연기 후드에 적절한 일회용 용기에 메틸 베노자테를 붓습니다. 1:1 저융점(56-57°C) 파라핀 왁스와 메틸벤조이트의 이전에 준비된 혼합물을 추가합니다. 이 시점부터 칼라는 파라핀이 굳어지지 않도록 65°C의 인큐베이터에 보관해야 합니다.
- 메틸베노자테와 파라핀 혼합물을 적절한 일회용 용기에 붓고, 65°C에 보관된 용융된 순수 파라핀 왁스를 칼라에 붓습니다.
- 30분 후에 파라핀을 변경하고 5회 이상 반복합니다. 적어도 6 - 8 세동을 수행해야합니다.
- 세치가 완료되면 칼라의 크기에 따라 슬롯이 있는 고무 아이스 큐브 트레이에 칼라를 넣습니다. 완전히 덮일 때까지 용융 파라핀을 붓고 O /N을 강하게하십시오 (기포를 피하십시오).
- 얼음 큐브 트레이에서 칼라가 들어 있는 파라핀 블록을 제거합니다. 면도날을 사용하여 파라핀 블록을 칼라에서 분리하여 칼라를 부드럽게 분리합니다. 머리는 파라핀 블록에 있을 것이고 시체는 칼라에 머무를 것입니다. 블록은 실온에서 보관할 수 있습니다.
- 칼라를 청소하려면 65°C의 데파라핀에 담그고 파라핀을 제거하고, 가벼운 스크러빙으로 청소하고, 재사용 하기 전에 에탄올로 세척하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
그림 1: 파라핀 시리얼 섹션. A) 칼라 방법을 사용하여 실험 및 제어 파리를 하나의 칼라에 스레딩하여 하나의 샘플로 처리 할 수 있습니다. 눈없는 죄 오큘리스 파리는 방향 (화살표)에 삽입됩니다. B) 칼라에 플라이 헤드의 방향을 보여주는 회로도. C) 이 이미지에서 다른 플라이 헤드의 섹션은 슬라이드에서 왼쪽에서 오른쪽으로 향합니다. 슬라이드의 위쪽에서 아래쪽으로 동일한 플라이 헤드의 직렬 섹션을 볼 수 있습니다. 이 경우, 사인 오큘리스 플라이가 3번(화살표)에 삽입되었다. 단면도는 절단 후에 단면도를 통해 서세하는 형광 눈 안료에 의해 얼룩됩니다. A = 5mm 및 C = 0.5mm의 배율 막대를 보려면 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collar | Genesee Scientific | TS 48-100 | We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee. |
| Rubber ice cube tray for embedding | Household store | The size can be made-to-fit by glueing in additional walls | |
| Crystallizing dish | Fisher Scientific Company | 08-762-3 | |
| Ether | Fisher Scientific Company | E138-1 | |
| Ethanol | Decon Laboratories Inc. | 2701 | |
| Choloroform | Fisher Scientific Company | C298-500 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Scientific Company | A38-212 | |
| Methylbenzoate | Fisher Scientific Company | M205-500 | Distinct Odor - Use in fume hood! |
| Low Melting Point Paraffin Wax | Fisher Scientific Company | T565 | Make sure to keep extra melted in a 65 °C waterbath |
