Embedding Voksen Drosophila Hoder i Paraffin: Forbereder vev for histologi

Overview

Denne videoen beskriver hvordan du legger inn Drosophila-hoder i parafin ved hjelp av kragemetoden, en teknikk som forbereder fluehoder for seriell seksjonering. Parafinseksjoner brukes til histologiske undersøkelser av hjernens anatomi og for vurdering av nevrodegenerasjon. Den omtalte protokollen demonstrerer hvordan flere fluer kan behandles i ett preparat, og dermed øke tidseffektiviteten og minimere eksperimentelle artefakter.

Protocol

Denne protokollen er et utdrag fra Sunderhaus og Kretzschmar, Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila, J. Vis. Exp. (2016).

1. Feste hodet på krager og legge inn i parafin

MERK: Alle trinnene i fikseringsprosessen skal gjøres i en avtrekkshette. Metylbenzoat, selv om det ikke utgjør en helserisiko, har en svært tydelig lukt, noe som kan være overveldende hvis det ikke håndteres i en avtrekkshette.

1. Før bedøvelse av fluene, utgjør 50 ml Carnoy-løsning ved å tilsette 15 ml kloroform og 5 ml issyre til 30 ml 99% etanol (ikke bland kloroform og eddiksyre). Hell den i en glassbeholder med en flat bunn, for eksempel en krystalliserende tallerken, for å sikre at kragene kan ligge flatt og er helt dekket av løsningen.
2. Bedøv fluene med CO₂ eller eter.
3. Trådfluer (opptil 20 med de fleste krager) ved halsen inn i kragene ved hjelp av tang. Husk å justere alle hodene i samme retning, som vist i figur 1A, og vær forsiktig for å sikre at det ikke oppstår skade på hodet eller øynene.
4. Inkluder sinus oculis fluer (piler, figur 1A) i tilfeldige posisjoner slik at rekkefølgen på fluene lett kan identifiseres i seksjonene. I tillegg, hvis de eksperimentelle fluene har en lys eller hvit øyenfarge, tre noen rødøyde fluer, for eksempel vill type, mellom dem for å sikre at tilstrekkelig pigment er til stede for å farge lysbildet. Registrer rekkefølgen på fluene på et protokollark sammen med halsbåndnummeret hvis du bruker mer enn én krage.
5. Når en krage er ferdig, plasser den i den forberedte Carnoy-løsningen i 3,5 - 4 timer.
6. Dump ut Carnoy-løsningen i riktig avhendingsbeholder og begynn etanolvaskene. Pass på å helle sakte for ikke å forstyrre plasseringen av kragene i beholderen.
7. Vask kragene i 30 min i 99% etanol to ganger.
8. Vask kragene i 100% etanol i 1 time. Pass på å bytte vaskene i tide for å forhindre overdehydrering.
9. Sett kragene i metylbenzoat O/N ved RT. Forsegle beholderen med parafilm for å forhindre fordampning av metylbenzoatet.
10. Hell metylbenozatet i riktig engangsbeholder i avtrekkshetten. Tilsett en tidligere tilberedt blanding av 1:1 lavt smeltepunkt (56 - 57 °C) parafinvoks og metylbenzoat. Fra dette tidspunktet må kragene holdes i en inkubator ved 65 °C for å sikre at parafinen ikke herdes.
11. Hell ut metylbenozat- og parafinblandingen i riktig engangsbeholder, og hell smeltet ren parafinvoks, holdt ved 65 °C, på kragene.
12. Bytt paraffin etter 30 min og gjenta dette minst 5 ganger. Minst 6 - 8 vasker skal utføres.
13. Når vasken er fullført, plasserer du kragene i en gummiisbitbrett med spor omtrent på størrelse med kragene. Hell smeltet parafin over dem til den er helt dekket og la den herde O / N (prøv å unngå luftbobler).
14. Fjern parafinblokkene som inneholder kragene fra isbitbrettet. Skill parafinblokken fra kragen med et barberblad, og bryt forsiktig av kragen. Hodene vil være i parafinblokken mens kroppene vil forbli i kragen. Blokkene kan holdes ved romtemperatur.
15. For å rengjøre kragene, suge dem i et deparafiniseringsmiddel ved 65 °C for å fjerne parafinen, rengjør med lett skrubbing og vask dem i etanol før gjenbruk.

Representative Results

Figur 1: Parafin serielle seksjoner. A) Ved hjelp av kragemetoden kan eksperimentelle og kontrollfluer behandles som en prøve ved å tre dem på en krage. Øyeløse sinus oculis fluer er satt inn for orientering (piler). B) Skjematisk som viser retningen på løpehodene i kragen. C) I dette bildet er seksjoner fra forskjellige løpehoder orientert fra venstre mot høyre på lysbildet. Fra topp til bunn på lysbildet kan du se serielle seksjoner fra samme løpehode. I dette tilfellet ble en sinus oculis fly satt inn i posisjon tre (pil). Seksjonene er farget av det fluorescerende øyepigmentet som vasker over seksjonene etter kutting. Skalastang i A = 5 mm og i C = 0,5 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collar	Genesee Scientific	TS 48-100	We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee.
Rubber ice cube tray for embedding	Household store		The size can be made-to-fit by glueing in additional walls
Crystallizing dish	Fisher Scientific Company	08-762-3
Ether	Fisher Scientific Company	E138-1
Ethanol	Decon Laboratories Inc.	2701
Choloroform	Fisher Scientific Company	C298-500
Glacial Acetic Acid	Fisher Scientific Company	A38-212
Methylbenzoate	Fisher Scientific Company	M205-500	Distinct Odor - Use in fume hood!
Low Melting Point Paraffin Wax	Fisher Scientific Company	T565	Make sure to keep extra melted in a 65 °C waterbath