Yetişkin Drosophila Kafalarını Parafin'e Gömmek: Histoloji için Doku Hazırlama

Overview

Bu videoda, seri kesitler için sinek kafaları hazırlayan bir teknik olan yaka yöntemini kullanarak Drosophila kafalarının parafin içine nasıl gömülecekleri açıklanmaktadır. Parafin bölümleri beynin anatomisinin histolojik incelemeleri ve nörodejenerasyonun değerlendirilmesi için kullanılır. Öne çıkan protokol, birden fazla sineklerin tek bir hazırlıkta nasıl işlenebileceğini, böylece zaman verimliliğinin artırılabileceğini ve deneysel eserlerin en aza indirilebileceğini göstermektedir.

Protocol

Bu protokol, Drosophila, J. Vis. Exp'teNörodejenerasyon'u Ölçmek için Sunderhaus ve Kretzschmar, Mass Histology'den bir alıntıdır. (2016).

1. Başı Yakalara Sabitlemek ve Parafin'e Gömmek

NOT: Fiksasyon sürecindeki tüm adımlar dumanlı bir başlıkta yapılmalıdır. Metilbenzoat, sağlık riski oluşturmasa da, duman kaputunda ele alınmazsa ezici olabilen oldukça belirgin bir kokuya sahiptir.

1. Sinekleri uyuşturmadan önce, % 99 etanol 30 mL'ye 15 mL kloroform ve 5 mL buzul asetik asit ekleyerek 50 mL Carnoy çözeltisini yapın (kloroform ve asetik asidi karıştırmayın). Yakaların düz bir şekilde uzanabilmesini ve tamamen çözelti tarafından kaplanmasını sağlamak için kristalize bir tabak gibi düz bir tabana sahip bir cam kaba dökün.
2. Sinekleri CO₂ veya eter ile uyuşturun.
3. İplik, boyunlarından yakalara askılar kullanarak uçar (çoğu yakalı 20'ye kadar). Şekil 1A'dagörüldüğü gibi tüm kafaları aynı yönde hizalamayı unutmayın ve kafaya veya gözlere herhangi bir hasar oluşmamasını sağlamak için nazik olun.
4. Sinüs oculis sineklerini (oklar, Şekil 1A)rastgele pozisyonlara ekleyin, böylece sineklerin sırası bölümlerde kolayca tanımlanabilir. Ek olarak, deneysel sinekler açık veya beyaz bir göz rengine sahipse, slaydı lekelendirmek için yeterli pigmentin mevcut olduğundan emin olmak için aralarında vahşi tip gibi bazı kırmızı gözlü sinekler iplik. Birden fazla yaka kullanıyorsanız, sineklerin sırasını yaka numarasıyla birlikte bir protokol levhasına kaydedin.
5. Bir yaka bittikten sonra, 3,5 - 4 saat boyunca hazırlanan Carnoy çözeltisine yerleştirin.
6. Carnoy çözeltisini uygun bertaraf kutusuna atın ve etanol yıkamaya başlayın. Tasmaların kabın içine yerleştirilmesini bozmamak için yavaşça döktüğünüzden emin olun.
7. Yakaları% 99 etanolde 30 dakika boyunca iki kez yıkayın.
8. Yakaları 1 saat boyunca% 100 etanolde yıkayın. Aşırı sulanmasını önlemek için yıkamaları zamanında değiştirdiğinden emin olun.
9. Rt'de yakaları metilbenzoat O/N'ye koyun.
10. Metilbenozat'ı duman kaputunda uygun tek kullanımlık kaba dökün. Önceden hazırlanmış 1:1 düşük erime noktası (56 - 57 °C) parafin balmumu ve metilbenzoat karışımı ekleyin. Bu noktadan sonra, parafin sertleşmemesi için tasmaların 65 ° C'de bir inkübatörde tutulması gerekir.
11. Metilbenozat ve parafin karışımını uygun tek kullanımlık kaba dökün ve 65 ° C'de tutulan erimiş saf parafin balmumunu yakalara dökün.
12. Parafin 30 dakika sonra değiştirin ve bunu en az 5 kez tekrarlayın. En az 6 - 8 yıkama yapılmalıdır.
13. Yıkamalar tamamlandıktan sonra, yakaları yaklaşık olarak yaka büyüklüğünde yuvalara sahip kauçuk bir buz küpü tepsisine yerleştirin. Tamamen kaplanana kadar üzerlerine erimiş parafin dökün ve O / N sertleşmesine izin verin (hava kabarcıklarından kaçınmaya çalışın).
14. Yakaları içeren parafin bloklarını buz küpü tepsisinden çıkarın. Parafin bloğunu jilet kullanarak yakadan ayırın, tasmayı hafifçe koparın. Cesetler yakada kalırken kafalar parafin bloğunda olacak. Bloklar oda sıcaklığında tutulabilir.
15. Yakaları temizlemek için, parafin çıkarmak için 65 ° C'de bir deparafinizasyon ajanına batırın, hafif ovma ile temizleyin ve yeniden kullanmadan önce etanolde yıkayın.

Representative Results

Şekil 1: Parafin Seri Bölümleri. A) Yaka yöntemi kullanılarak deneysel ve kontrol sinekleri tek yaka üzerine geçirilerek tek örnek olarak işlenebilir. Gözsüz sinüs oculis sinekleri oryantasyon için yerleştirilir (oklar). B) Yakadaki sinek başlarının yönünü gösteren şematik. C) Bu resimde, farklı sinek kafalarından bölümler slaytta soldan sağa yönlendirilir. Slaytta yukarıdan aşağıya, aynı sinek kafasından seri bölümler görülebilir. Bu durumda, üçüncü konuma (ok) bir sinüs oculis sinesi sinesi sine yerleştirildi. Bölümler, kesildikten sonra bölümlerin üzerinde yıkanan floresan göz pigmenti ile lekelenir. Çubuğu A = 5 mm ve C = 0,5 mm olarak ölçeklendirin.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collar	Genesee Scientific	TS 48-100	We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee.
Rubber ice cube tray for embedding	Household store		The size can be made-to-fit by glueing in additional walls
Crystallizing dish	Fisher Scientific Company	08-762-3
Ether	Fisher Scientific Company	E138-1
Ethanol	Decon Laboratories Inc.	2701
Choloroform	Fisher Scientific Company	C298-500
Glacial Acetic Acid	Fisher Scientific Company	A38-212
Methylbenzoate	Fisher Scientific Company	M205-500	Distinct Odor - Use in fume hood!
Low Melting Point Paraffin Wax	Fisher Scientific Company	T565	Make sure to keep extra melted in a 65 °C waterbath