将成人 嗜血杆菌 头嵌入石蜡中：为组织组织准备组织

Overview

此视频描述了如何使用领子方法将 Drosophila 头嵌入石蜡中，这是一种为连续剖面准备飞头的技术。石蜡部分用于大脑解剖学的组学检查和神经退化评估。特色协议演示了如何在一次制备中处理多个苍蝇，从而提高时间效率并最大限度地减少实验文物。

Protocol

本协议摘自桑德豪斯和克雷茨奇马尔，大规模组织学量化神经退化在德罗索菲拉，J.维斯Exp。(2016).

1. 修复衣领上的头部和嵌入石蜡

注： 固定过程中的所有步骤都应在烟雾罩中完成。甲基苯甲酸酯虽然不会对健康造成危害，但气味非常明显，如果不在烟罩中处理，气味可能非常强烈。

1. 在给苍蝇麻醉之前，通过在30mL的99%乙醇中加入15mL的氯仿和5mL的冰川醋酸（不要混合氯仿和醋酸），组成50mL的卡诺伊溶液。将其倒入具有平底的玻璃容器中，如结晶盘，以确保衣领可以平放，并完全被溶液覆盖。
2. 用_二氧化碳 或乙醚麻醉苍蝇。
3. 线程飞行（最多20与大多数衣领）由他们的脖子到衣领使用钳子。请记住，在 图 1A中看到的那样，将所有头部对齐在相同的方向上，并温柔地确保头部或眼睛不会受到损伤。
4. 在随机位置包括 内西内奥库利斯 苍蝇（箭头， 图1A），以便在各部分轻松识别苍蝇的顺序。此外，如果实验苍蝇有光或白眼的颜色，线程一些红眼苍蝇，如野生类型，它们之间，以确保有足够的色素存在污渍幻灯片。如果使用多个领子，则将苍蝇的顺序与领号一起记录在协议表上。
5. 衣领完成后，将其放置在准备好的卡诺伊溶液中，3.5 - 4 小时。
6. 将卡诺伊溶液倒入适当的处理罐中，然后开始洗乙醇。一定要慢慢倒，以免打扰衣领在容器中的位置。
7. 在99%乙醇中清洗衣领30分钟两次。
8. 用100%乙醇清洗衣领1小时。请务必按时更换洗涤液，以防止过度脱水。
9. 将衣领放入 RT 的甲基苯甲酸酯 O/N 中，用对羟基苯甲酸酯密封容器，以防止甲基苯甲酸酯蒸发。
10. 将甲基苯甲酸酯倒入烟气罩中适当的一次性容器中。加入先前准备的1：1低熔点（56 - 57 °C）石蜡和甲基苯甲酸酯的混合物。从那时起，衣领需要保存在65°C的孵化器中，以确保石蜡不会变硬。
11. 将甲基苯甲酸酯和石蜡混合物倒入适当的一次性容器中，并将保持在 65 °C 的熔融纯石蜡倒入衣领上。
12. 30分钟后更换石蜡，重复至少5次。至少应进行 6 - 8 次洗涤。
13. 洗完后，将衣领放入橡胶冰块托盘中，其槽的大小与衣领差不多。将熔融的石蜡倒在他们身上，直到完全覆盖，并允许它硬化O/N（尽量避免气泡）。
14. 从冰块托盘中取出包含衣领的石蜡块。使用剃须刀刀片将石蜡块与衣领分开，轻轻折断衣领。头部将位于石蜡块中，而身体将留在衣领中。这些方块可以保持在室温下。
15. 要清洁衣领，请在 65 °C 时将衣领浸泡在去帕拉芬剂中，取出石蜡，用轻洗清洗清洁，并在重复使用前用乙醇清洗。

Representative Results

图1：石蜡串行部分。A）使用领子方法，实验苍蝇和控制苍蝇可以通过将它们串联到一个衣领上作为一个样本进行处理。无眼正弦苍蝇入方向（箭头）。B）示意图显示衣领中飞头的方向。C）在此图像中，不同飞头的部分在幻灯片上从左到右定向。从上到下在幻灯片上，可以看到来自同一飞头的序列部分。在这种情况下，在位置三（箭头）插入了正弦苍蝇。这些部分被切割后在部分上清洗的荧光眼色素弄脏。A = 5 毫米和 C = 0.5 毫米的缩放栏。请单击此处查看此图的较大版本。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collar	Genesee Scientific	TS 48-100	We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee.
Rubber ice cube tray for embedding	Household store		The size can be made-to-fit by glueing in additional walls
Crystallizing dish	Fisher Scientific Company	08-762-3
Ether	Fisher Scientific Company	E138-1
Ethanol	Decon Laboratories Inc.	2701
Choloroform	Fisher Scientific Company	C298-500
Glacial Acetic Acid	Fisher Scientific Company	A38-212
Methylbenzoate	Fisher Scientific Company	M205-500	Distinct Odor - Use in fume hood!
Low Melting Point Paraffin Wax	Fisher Scientific Company	T565	Make sure to keep extra melted in a 65 °C waterbath