Intégrer des têtes adultes de drosophile dans la paraffine : Préparer les tissus à l’histologie

Overview

Cette vidéo décrit comment intégrer les têtes de Drosophila dans la paraffine en utilisant la méthode du collier, une technique qui prépare les têtes volantes pour la section en série. Les sections de paraffine sont utilisées pour les examens histologiques de l’anatomie du cerveau et pour l’évaluation de la neurodégénérescence. Le protocole en vedette montre comment plusieurs mouches peuvent être traitées en une seule préparation, augmentant ainsi l’efficacité du temps et minimisant les artefacts expérimentaux.

Protocol

Ce protocole est un extrait de Sunderhaus et Kretzschmar, Histologie de masse pour quantifier la neurodégénérescence à Drosophila, J. Vis. Exp. (2016).

1. Fixation de la tête sur les colliers et intégration à Paraffin

REMARQUE: Toutes les étapes du processus de fixation doivent être effectuées dans une hotte fumigène. Le méthylbenzoate, bien qu’il ne pose pas de risque pour la santé, a une odeur très distincte, qui peut être écrasante si elle n’est pas manipulée dans une hotte de fumée.

1. Avant d’anesthésier les mouches, composent 50 mL de solution Carnoy en ajoutant 15 mL de chloroforme et 5 mL d’acide acétique glaciaire à 30 mL d’éthanol à 99 % (ne mélangez pas le chloroforme et l’acide acétique). Versez-le dans un récipient en verre avec un fond plat, comme un plat cristallisant, pour s’assurer que les colliers peuvent poser à plat et sont complètement couverts par la solution.
2. Anesthésier les mouches avec du CO_{2 ou de} l’éther.
3. Le fil vole (jusqu’à 20 avec la plupart des colliers) par leurs cous dans les colliers à l’aide de forceps. N’oubliez pas d’aligner toutes les têtes dans la même orientation, comme on le voit dans la figure 1A,et soyez doux pour vous assurer qu’aucun dommage ne se produit à la tête ou aux yeux.
4. Inclure des mouches sinusoculées (flèches, figure 1A)à des positions aléatoires afin que l’ordre des mouches puisse être facilement identifié dans les sections. En outre, si les mouches expérimentales ont une couleur oculaire claire ou blanche, enfiler certaines mouches aux yeux rouges, comme le type sauvage, entre elles pour s’assurer qu’un pigment suffisant est présent pour tacher la toboggan. Enregistrez l’ordre des mouches sur une feuille de protocole avec le numéro de collier si vous utilisez plus d’un collier.
5. Une fois qu’un collier a été terminé, placez-le dans la solution Carnoy préparée pour 3,5 - 4 h.
6. Déversez la solution Carnoy dans la boîte d’élimination appropriée et commencez les lavages à l’éthanol. Assurez-vous de verser lentement afin de ne pas perturber le placement des colliers dans le récipient.
7. Lavez les colliers pendant 30 min dans 99% d’éthanol deux fois.
8. Laver les colliers à 100 % d’éthanol pendant 1 h. Assurez-vous de changer les lavages à temps pour éviter la surdéhydratation.
9. Mettre les colliers dans le méthylbenzoate O/N à RT. Sceller le récipient avec du parafilm pour éviter l’évaporation du méthylbenzoate.
10. Verser le méthylbenozate dans le récipient jetable approprié dans le capot de fumée. Ajouter un mélange préparé précédemment de 1:1 point de fusion faible (56 - 57 °C) de cire de paraffine et de méthylbenzoate. A partir de là, les colliers doivent être conservés dans un incubateur à 65 °C pour s’assurer que la paraffine ne durcit pas.
11. Verser le mélange de méthylbenozate et de paraffine dans le récipient jetable approprié, et verser la cire de paraffine pure fondue, conservée à 65 °C, sur les colliers.
12. Changer la paraffine après 30 min et répéter au moins 5 fois. Au moins 6 à 8 lavages doivent être effectués.
13. Une fois les lavages terminés, placez les colliers dans un bac à glaçons en caoutchouc avec des fentes d’environ la taille des colliers. Verser la paraffine fondue sur eux jusqu’à ce qu’elle soit complètement couverte et lui permettre de durcir O/N (essayez d’éviter les bulles d’air).
14. Retirer les blocs de paraffine contenant les colliers du bac à glaçons. Séparez le bloc de paraffine du col à l’aide d’une lame de rasoir, en cassant doucement le collier. Les têtes seront dans le bloc de paraffine tandis que les corps resteront dans le col. Les blocs peuvent être conservés à température ambiante.
15. Pour nettoyer les colliers, trempez-les dans un agent de déparafinisation à 65 °C pour enlever la paraffine, nettoyer avec un nettoyage léger et laver à l’éthanol avant de le réutiliser.

Representative Results

Figure 1 : Sections périodiques de paraffine. A) En utilisant la méthode du collier, les mouches expérimentales et de contrôle peuvent être traitées comme un seul échantillon en les enfilant sur un collier. Les mouches sinusoculées sans yeux sont insérées pour l’orientation (flèches). B) Schéma montrant l’orientation des têtes de mouche dans le col. C) Dans cette image, les sections de différentes têtes volantes sont orientées de gauche à droite sur la diapositive. De haut en bas sur la diapositive, des sections en série de la même tête de mouche peuvent être vues. Dans ce cas, une mouche sinusoculite a été insérée à la position trois (flèche). Les sections sont tachées par le pigment fluorescent des yeux qui se lave sur les sections après la coupe. Barre d’échelle en A = 5 mm et en C = 0,5 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collar	Genesee Scientific	TS 48-100	We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee.
Rubber ice cube tray for embedding	Household store		The size can be made-to-fit by glueing in additional walls
Crystallizing dish	Fisher Scientific Company	08-762-3
Ether	Fisher Scientific Company	E138-1
Ethanol	Decon Laboratories Inc.	2701
Choloroform	Fisher Scientific Company	C298-500
Glacial Acetic Acid	Fisher Scientific Company	A38-212
Methylbenzoate	Fisher Scientific Company	M205-500	Distinct Odor - Use in fume hood!
Low Melting Point Paraffin Wax	Fisher Scientific Company	T565	Make sure to keep extra melted in a 65 °C waterbath