حقن الذباب Drosophila الكبار: طريقة لتسليم المركب أو التسمية

Overview

يصف هذا الفيديو كيفية إجراء حقنة من الذباب البالغ الحي ويتضمن بروتوكولا نموذجيا يتم فيه حقن الجسيمات المسماة والمثقب الأزرق في بطن الذبابة لتقصي داء البلعوس.

Protocol

هذا البروتوكول هو مقتطف من نازاريو تول وو ، وتقييم الاستجابة المناعية الخلوية لذبابة الفاكهة ، Drosophila melanogaster، باستخدام اختبار في Vivo Phagocytosis ، J. Vis. Exp. (2019).

1. إعداد جزيئات الفلورسين للحقن

1. إعادة تشكيل 10 ملغ من جزيئات البكتيريا المتاحة تجاريا، قتل الحرارة المسمى مع الفلورسين (انظر جدول المواد)إلى تركيز المخزون من 10 ملغم / مل عن طريق إضافة 990 ميكرولتر عقيمة 1x PBS و 10 ميكرولتر 50 مللي متر الصوديوم azide. دوامة لخلط.
   1. تقسيم إلى استخدام واحد 8 μL aliquots في أنابيب 0.2 مل وتخزينها في مربع مظلم في 4 درجة مئوية للحد من الحساسية المرتبطة الضوء.
      ملاحظة: الصوديوم azide الحافظة اختياري ويمكن حذفها إذا 10 مصنوعة من المخزونات ملغ / مل مع 1 مل عقيمة 1x PBS، aliquoted، وتخزينها في -20 درجة مئوية.
2. جعل حل 10 مل من 5٪ تلوين الطعام في برنامج تلفزيوني 1x عن طريق خلط 500 μL حقنة تصفية تلوين الطعام الأخضر و 9.5 مل عقيمة 1x PBS.
3. غسل الجسيمات قبل الحقن لإزالة أزيد الصوديوم. مزيج 42 ميكرولتر عقيمة 1x PBS و 8 ميكرولتر من 10 ملغم / مل في أنبوب 1.7 مل. جهاز طرد مركزي بأقصى سرعة لمدة 2.5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   1. إزالة supernatant، إضافة 50 ميكرولتر 1x برنامج تلفزيوني، والطرد المركزي في أقصى سرعة لمدة 2.5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   2. كرر الخطوتين 1.3 و 1.3.1 2x، لما مجموعه 3 يغسل.
   3. بعد الغسيل النهائي، تجاهل الجسيمات الفائقة وإعادة تعليق إلى 1.6 ملغم / مل في 50 ميكرولتر من 5٪ تلوين الطعام في برنامج تلفزيوني 1x.
   4. التفاف أنبوب في رقائق الألومنيوم للحماية من الضوء. يخزن عند درجة حرارة 4 درجات مئوية، ويترك بعد أسبوع واحد.

2. إعداد محطة الحقن والذباب

1. إعداد لوحة الحقن. لحقن ما يصل إلى 4 أنماط جينية من الذباب في نفس الوقت، استخدم الشريط المختبري لتقسيم منصة_ذبابة ثاني أكسيد الكربون المستطيلة إلى 4 أقسام. على مقاعد البدلاء بالقرب من المجهر، تعيين المناطق لوضع قوارير مرة واحدة وقد اصطف الذباب على لوحة (واحد لكل ركن من أركان لوحة).
2. إعداد قنينات من العمر مطابقة, 4-7 أيام من العمر, الذباب للحقن. لكل سلالة ليتم اختبارها، نقل 5 ذكور و 5 إناث إلى قارورة جديدة، وصفت من الطعام يطير المعدة والحفاظ على 25 درجة مئوية.
3. إعداد حاقن هوائي (انظر جدول المواد) عنطريق تعيين الصك إلى 100 مللي ثانية (رشقات نارية قصيرة من ضغط الغاز لطرد السائل – السماح بتسليم وحدات التخزين نانولتر الفرعية) وضع TIMED.
4. إعداد الشرائح المجهر. قطع شرائط 1.5 بوصة من الشريط الكهربائي، أضعاف في حلقة مع الجانب لاصقة بها، ووضعها على شريحة المجهر المسمى.

3. إعداد الإبر الشعرية الزجاجية

1. سحب الإبر الزجاجية (الشعيرات الدموية الزجاج الجدار رقيقة) باستخدام سحب إبرة.
   1. عقد الإبرة تحت المجهر مع ميكرومتر وكسر طرف باستخدام #5 نقطة دقيقة ملاقط الفولاذ المقاوم للصدأ. نصائح 100 ميكرومتر كافية لاختراق لطيف الذبابة مع تقليل الجرح.
   2. قياس حجم السائل الذي سيتم حقنه في كل ذبابة. تحميل الإبرة مع معقمة 5٪ تلوين الطعام في برنامج تلفزيوني 1x وطرد السائل على قطرة من الزيت المعدني على ميكرومتر المرحلة 0.01 ملم.
      ملاحظة: إذا كانت القطيرات السائلة كروية، يتم حساب الحجم في picoliters على أنه (حجم)³/1910. إبرة بقطر 100 ميكرومتر سوف يقذف ~ 2 nL في 100 مللي ثانية.

4. حقن الذباب

1. ماصة 10 ميكرولتر من 1.6 ملغ / مل الجسيمات على مربع صغير من البارافيلم.
   1. سحب السائل في الإبرة وجبل في فوهة حاقن (انظر جدول المواد).
   2. تخدير الذباب مع CO₂ وخط لهم حتى في المنطقة المحددة على flypad، مع الجانب البطني صعودا ورؤساء موجهة نحو الجزء الأمامي من لوحة. وضع قوارير في المناطق المقابلة على مقاعد البدلاء.
   3. حقن الذباب في الزاوية العليا من البطن مع مضخات 5، 100 مللي ثانية من السائل (~ 10 nL المجموع).
   4. نقل الذباب المحقون إلى قوارير المناسبة، لاحظ الوقت على القارورة. ابق عند 25 درجة مئوية.
2. تحميل إبرة جديدة مع 0.4٪ Trypan الحل الأزرق.
3. تعيين حاقن هوائي إلى GATED، والذي يسمح تدفق مستمر من الهواء لدفع السائل من الإبرة.
4. تخدير الذباب بعد أن يستريح لمدة 30 دقيقة وحقن مع تريبان الأزرق حتى البطن ممتلئة ومنتفخة.
   ملاحظة: عند فحص نضوج البلعوم مع الجسيمات المسماة بصبغة حساسة ل درجة الحموضة ، اسمح للذباب بالراحة لمدة ساعة واحدة ولا تحقن باللون الأزرق المثقب قبل تصاعد الذباب.
5. جبل الذباب على الشرائح المجهر مع الشريط الكهربائي، الجانب البطني إلى أسفل. دفع الأجنحة إلى جانب الذبابة وتأمينها على الشريط. أيضا، دفع بلطف الرأس في الشريط لضمان أن الذبابة لن تتحرك.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5430-10 PicoNozzle Kit	World Precision Instruments	5430-10	Holder for 1.0mm pipette
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	E2861	Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm)
Needle Pipette Puller	David Kopf Instruments	Model 725
Pneumatic PicoPump PV820	World Precision Instruments	SYS-PV820	The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid – allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables – the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms "TIMED" mode.
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100F-3	Needles for injection. OD = 1.0 mm
Trypan Blue Solution (0.4%)	Sigma	T8154	Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles.