Injectie van volwassen Drosophila-vliegen: een methode voor samengestelde of labelafgifte

Overview

Deze video beschrijft hoe een injectie van levende volwassen vliegen uit te voeren en bevat een voorbeeldprotocol waarin gelabelde deeltjes en trypanblauw in de buik van vliegen worden geïnjecteerd om fagocytose te meten.

Protocol

Dit protocol is een fragment uit Nazario-Toole en Wu, Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay, J. Vis. Exp. (2019).

1. Bereid fluoresceïnedeeltjes voor op injectie

1. Reconstitueer 10 mg in de handel verkrijgbare, warmtegedode bacteriedeeltjes gelabeld met fluoresceïne (zie tabel met materialen)tot een voorraadconcentratie van 10 mg/ml door toevoeging van 990 μL steriel 1x PBS en 10 μL 50 mM natrium azide. Vortex om te mengen.
   1. Verdeel in 8 μL aliquots voor eenmalig gebruik in buizen van 0,2 ml en bewaar in een donkere doos bij 4 °C om de lichtgevoeligheid te minimaliseren.
      OPMERKING: Natrium azide conserveermiddel is optioneel en kan worden weggelaten als 10 mg/ml voorraden worden gemaakt met 1 ml steriel 1x PBS, aliquoted, en opgeslagen bij -20 °C.
2. Maak een 10 ml oplossing van 5% voedselkleuring in 1x PBS door 500 μL spuit gefilterde groene voedselkleurstof en 9,5 ml steriel 1x PBS te mengen.
3. Was deeltjes voor injectie om natrium azide te verwijderen. Meng 42 μL steriel 1x PBS en 8 μL van 10 mg/ml in een buis van 1,7 ml. Centrifugeer op maximale snelheid gedurende 2,5 min bij kamertemperatuur.
   1. Verwijder het supernatant, voeg 50 μL 1x PBS toe en centrifugeer op maximale snelheid gedurende 2,5 min bij kamertemperatuur.
   2. Herhaal stap 1.3 en 1.3.1 2x, voor in totaal 3 wasbeurten.
   3. Gooi na de laatste wasbeurt het supernatant weg en strek de deeltjes opnieuw op tot 1,6 mg/ml in 50 μL van 5% voedselkleurstof in 1x PBS.
   4. Wikkel de buis in aluminiumfolie om te beschermen tegen licht. Bewaren bij 4 °C, na 1 week weggooien.

2. Bereid het injectiestation voor en vlieg

1. Bereid het injectiekussen voor. Om maximaal 4 genotypen vliegen tegelijkertijd te injecteren, gebruikt u laboratoriumtape om een rechthoekig CO_{2-vliegenkussen} in 4 secties te verdelen. Wijs op de bank bij de microscoop gebieden aan om de flacons te plaatsen zodra vliegen op de pad zijn opgesteld (één voor elke hoek van de pad).
2. Bereid flesjes van leeftijdsgematchte, 4-7 dagen oude vliegen voor injectie. Breng voor elke te testen soort 5 mannetjes en 5 vrouwtjes over in een verse, gelabelde flacon bereid vliegvoer en houd deze op 25 °C.
3. Bereid de pneumatische injector voor (zie tabel met materialen)door het instrument in te stellen op een timed-modus van 100 ms (korte uitbarstingen van gasdruk om de vloeistof te verdrijven - waardoor subnanolitervolumes kunnen worden geleverd).
4. Bereid de microscoopglaasjes voor. Knip 1,5-inch stroken elektrische tape, vouw in een lus met de zelfklevende kant naar buiten en plaats op een gelabelde microscoopschuif.

3. Bereid glazen capillaire naalden

1. Trek glazen naalden (dunne wand glazen haarvaten) met behulp van een naaldtrekker.
   1. Houd de naald met een micrometer onder de microscoop en breek de punt met #5 roestvrijstalen pincet met fijne punt. 100 μm tips zijn voldoende om de cuticula van de vlieg te doorboren terwijl het verwonden wordt geminimaliseerd.
   2. Meet het volume vloeistof dat in elke vlieg wordt geïnjecteerd. Laad de naald met steriele 5% voedselkleurstof in 1x PBS en verdrijf de vloeistof op een druppel minerale olie op een micrometer van 0,01 mm.
      OPMERKING: Als de vloeibare druppel bolvormig is, wordt het volume in picoliters berekend als (grootte)³/1910. Een naald met een diameter van 100 μm zal ~2 nL in 100 ms uitwerpen.

4. Injecteer vliegen

1. Pipet 10 μL van 1,6 mg/ml deeltjes op een klein vierkantje parafilm.
   1. Trek de vloeistof in de naald en monteer deze in het spuitmondje van de injector (zie tabel met materialen).
   2. Verdoof vliegen met CO₂ en zet ze op hun aangewezen gebied op het flypad, met de ventrale kant naar boven en de hoofden gericht op de voorkant van het pad. Plaats flacons in overeenkomstige gebieden op de bank.
   3. Injecteer vliegen in de bovenhoek van de buik met 5, 100 ms pompen van vloeistof (~ 10 nL totaal).
   4. Breng de geïnjecteerde vliegen over naar de juiste flacons, noteer de tijd op de flacon. Bewaren bij 25 °C.
2. Laad een nieuwe naald met 0,4% Trypan Blue Solution.
3. Stel de pneumatische injector in op GATED, waardoor een constante luchtstroom de vloeistof uit de naald kan duwen.
4. Verdoof vliegen nadat ze 30 minuten hebben uitgerust en injecteer met Trypan Blue totdat de buik vol en opgezwollen is.
   OPMERKING: Laat vliegen bij het onderzoeken van fagosome rijping met deeltjes gelabeld met een pH-gevoelige kleurstof 1 uur rusten en injecteer niet met trypanblauw voordat u vliegen monteert.
5. Monteer vliegen op microscoopglijbanen met elektrische tape, ventrale kant naar beneden. Duw de vleugels naar de zijkant van de vlieg en zet ze vast aan de tape. Duw ook voorzichtig het hoofd in de tape om ervoor te zorgen dat de vlieg niet beweegt.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5430-10 PicoNozzle Kit	World Precision Instruments	5430-10	Holder for 1.0mm pipette
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	E2861	Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm)
Needle Pipette Puller	David Kopf Instruments	Model 725
Pneumatic PicoPump PV820	World Precision Instruments	SYS-PV820	The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid – allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables – the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms "TIMED" mode.
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100F-3	Needles for injection. OD = 1.0 mm
Trypan Blue Solution (0.4%)	Sigma	T8154	Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles.