Yetişkin Drosophila Sineklerinin Enjeksiyonu: Bileşik veya Etiket Teslimi Yöntemi

Overview

Bu video, canlı yetişkin sinek enjeksiyonunun nasıl gerçekleştirildiğini açıklar ve etiketli parçacıkların ve trippan mavisinin fagositozu test etmek için sinek karınlarına enjekte edildiği örnek bir protokol içerir.

Protocol

Bu protokol Nazario-Toole ve Wu'dan bir alıntıdır, Meyve Sineğinin Hücresel Bağışıklık Tepkisini Değerlendiren, Drosophila melanogaster, In Vivo Phagocytosis Tahlil Kullanarak, J. Vis. Exp. (2019).

1. Floresan parçacıklarını enjeksiyon için hazırlayın

1. 990 μL steril 1x PBS ve 10 μL 50 mM sodyum azit ekleyerek 10 mg/mL stok konsantrasyonuna floresan (bkz. Malzeme Tablosu)ile etiketlenmiş 10 mg ticari olarak mevcut, ısıdan öldürülmüş bakteri parçacıklarını yeniden inşa edin. Karıştırmak için girdap.
   1. 0,2 mL tüplerde tek kullanımlık 8 μL aliquot'lara bölün ve ışığa bağlı hassasiyeti en aza indirmek için 4 °C'de koyu bir kutuda saklayın.
      NOT: Sodyum azit koruyucu isteğe bağlıdır ve 10 mg/mL stoklar 1 mL steril 1x PBS ile yapılırsa, aliquoted ve -20 °C'de saklanırsa atlanabilir.
2. 500 μL filtreli yeşil gıda renklendirmesi ve 9,5 mL steril 1x PBS karıştırarak 1x PBS'de % 5 gıda renklendirmesinin 10 mL'lik bir çözeltisini yapın.
3. Sodyum azidini çıkarmak için enjeksiyondan önce parçacıkları yıkayın. 1,7 mL'lik bir tüpte 42 μL steril 1x PBS ve 8 μL 10 mg/mL karıştırın. Oda sıcaklığında 2,5 dakika maksimum hızda santrifüj.
   1. Süpernatantı çıkarın, 50 μL 1x PBS ekleyin ve oda sıcaklığında 2,5 dakika maksimum hızda santrifüjleyin.
   2. Toplam 3 yıkama için 1.3 ve 1.3.1 2x adımlarını yineleyin.
   3. Son yıkamadan sonra, süpernatant atın ve parçacıkları 1x PBS'de% 5 gıda renklendirmesinin 50 μL'sinde 1,6 mg / mL'ye yeniden askıya alın.
   4. Işıktan korunmak için tüpü alüminyum folyoya sarın. 4 °C'de saklayın, 1 hafta sonra atın.

2. Enjeksiyon istasyonunu hazırlayın ve uçar

1. Enjeksiyon yastığını hazırlayın. Aynı anda 4 genotipe kadar sinek enjekte etmek için, dikdörtgen bir CO 2 fly pad'i₄ bölüme bölmek için laboratuvar bandı kullanın. Mikroskobun yakınındaki bankta, sinekler ped üzerine dizildikten sonra şişeleri yerleştirmek için alanlar belirleyin (pedin her köşesi için bir tane).
2. Yaş uyumlu, 4-7 günlük, enjeksiyon için sinek şişeleri hazırlayın. Test edilecek her suş için, 5 erkek ve 5 dişiyi taze, etiketli hazırlanmış sinek yemi şişesine aktarın ve 25 ° C'de tutun.
3. Pnömatik enjektörü hazırlayın (bkz. Malzeme Tablosu),cihazı 100 ms 'ye (sıvıyı dışarı çıkarmak için kısa gaz basıncı patlamaları) ayarlayarak - nanoliter altı hacimlerin teslim edilmesini sağlayarak) TIMED modu.
4. Mikroskop slaytlarını hazırlayın. 1,5 inçlik elektrik bandı şeritlerini kesin, yapışkan tarafı açık bir döngüye katlayın ve etiketli bir mikroskop kaydırağı üzerine yerleştirin.

3. Cam kılcal iğneler hazırlayın

1. İğne çekerek cam iğneleri (ince duvar cam kılcal damarlar) çekin.
   1. İğneyi mikrometre ile mikroskop altında tutun ve ince noktalı paslanmaz çelik cımbızlar kullanarak ucu #5. 100 μm uçlar, yarayı en aza indirirken sineğin maniklesini delmek için yeterlidir.
   2. Her sineğe enjekte edilecek sıvı hacmini ölçün. İğneyi 1x PBS'de steril % 5 gıda renklendirmesi ile yükleyin ve sıvıyı 0,01 mm'lik bir aşama mikrometre üzerinde bir damla mineral yağ üzerine dışarı atın.
      NOT: Sıvı damlacık küresel ise, picoliters hacmi (boyut)^{3 /1910}olarak hesaplanır. 100 μm çapında bir iğne 100 ms'de ~2 nL atar.

4. Sinekleri enjekte edin

1. Pipet 10 μL 1.6 mg/mL parçacıklar küçük bir parafilm karesi üzerine.
   1. Sıvıyı iğneye çekin ve enjektör nozülüne monte edin (bkz. Malzeme Tablosu).
   2. Co₂ ile sinekleri uyuşturun ve ventral tarafı yukarı ve kafalar pedi ön tarafa doğru olacak şekilde flypad'de belirlenen alanlarına dizin. Şişeleri tezgahta ilgili alanlara yerleştirin.
   3. 5,100 ms sıvı pompaları (toplam ~ 10 nL) ile karnın üst köşesine sinek enjekte edin.
   4. Enjekte edilen sinekleri uygun şişelere aktarın, şişedeki zamanı not edin. 25 °C'de tutun.
2. % 0.4 Trypan Mavi Çözeltisi ile yeni bir iğne yükleyin.
3. Pnömatik enjektörü GATED'e ayarlayın, bu da sıvıyı iğneden dışarı itmek için sabit bir hava akışı sağlar.
4. 30 dakika dinlendikten sonra sinekleri uyuşturun ve karın dolana ve şişkin olana kadar Trypan Blue ile enjekte edin.
   NOT: pH'a duyarlı bir boya ile etiketlenmiş parçacıklarla fagozom olgunlaşmasını incelerken, sineklerin 1 saat dinlenmesine izin verin ve sinekleri monte etmeden önce trippan mavisi ile enjekte etmeyin.
5. Mikroskoptaki sinekler elektrik bandıyla kayar, ventral tarafı aşağı. Kanatları sineğin kenarına itin ve bantla sabitleyin. Ayrıca, sineğin hareket etmeyeceğine emin olmak için başı yavaşça bant içine itin.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5430-10 PicoNozzle Kit	World Precision Instruments	5430-10	Holder for 1.0mm pipette
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	E2861	Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm)
Needle Pipette Puller	David Kopf Instruments	Model 725
Pneumatic PicoPump PV820	World Precision Instruments	SYS-PV820	The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid – allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables – the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms "TIMED" mode.
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100F-3	Needles for injection. OD = 1.0 mm
Trypan Blue Solution (0.4%)	Sigma	T8154	Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles.