वयस्क ड्रोसोफिला मक्खियों का इंजेक्शन: यौगिक या लेबल डिलीवरी की एक विधि

Overview

यह वीडियो जीवित वयस्क मक्खियों का इंजेक्शन कैसे करता है और इसमें एक उदाहरण प्रोटोकॉल शामिल है जिसमें लेबल वाले कण और ट्राइपैन ब्लू को फ्लाई पेट में परख फैगोसाइटोसिस में इंजेक्ट किया जाता है।

Protocol

यह प्रोटोकॉल नाजारियो-टूल और वू का एक अंश है, जो फ्रूट फ्लाई, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टरकी सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का आकलन करता है, जो वीवो फागोसाइटोसिस परख, जे विस एक्सपी (2019) में एक का उपयोग कर रहा है।

1. इंजेक्शन के लिए फ्लोरोसिन कण तैयार करें

1. 10 मिलीग्राम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध, गर्मी से मारे गए बैक्टीरिया कणों को फ्लोरोसेइन (सामग्री की तालिकादेखें) के साथ 990 माइक्रोन बाँझ 1x पीबीएस और 10 माइक्रोन 50 मिलीग्राम सोडियम अजीमाइड जोड़कर 10 मिलीग्राम/ भंवर मिश्रण करने के लिए।
   1. 0.2 एमएल ट्यूब में एकल उपयोग 8 μL aliquots में विभाजित करें और प्रकाश से जुड़ी संवेदनशीलता को कम करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक अंधेरे बॉक्स में स्टोर करें।
      नोट: सोडियम अज़ाइड परिरक्षक वैकल्पिक है और यदि 10 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक 1 एमएल बाँझ 1x पीबीएस, एलिकोटेड के साथ बनाए जाते हैं, और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जाते हैं तो छोड़ा जा सकता है।
2. 500 माइक्रोन सिरिंज फ़िल्टर ग्रीन फूड कलरिंग और 9.5 एमएल बाँझ 1x पीबीएस मिलाकर 1x पीबीएस में 5% फूड कलरिंग का 10 एमएल घोल बनाएं।
3. सोडियम एजाइड को हटाने के लिए इंजेक्शन से पहले कणों को धोएं। 1.7 एमएल ट्यूब में 42 माइक्रोन बाँझ 1x पीबीएस और 10 मिलीग्राम/एमएल के 8 माइक्रोन मिलाएं। कमरे के तापमान पर 2.5 मिनट के लिए अधिकतम गति पर सेंट्रलाइज।
   1. सुपरनैंट निकालें, कमरे के तापमान पर 2.5 मिनट के लिए अधिकतम गति पर 50 माइक्रोन 1x पीबीएस जोड़ें, और अपकेंद्रित्र करें।
   2. कुल 3 वॉश के लिए 1.3 और 1.3.1 2x चरण दोहराएं।
   3. अंतिम धोने के बाद, 1x पीबीएस में 5% भोजन रंग के 50 माइक्रोन में सुपरनैंट और री-सस्पेंड कणों को 1.6 मिलीग्राम/एमएल में त्यागें।
   4. प्रकाश से बचाने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में ट्यूब लपेटें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, 1 सप्ताह के बाद त्यागें।

2. इंजेक्शन स्टेशन और मक्खियों को तैयार करें

1. इंजेक्शन पैड तैयार करें। एक ही समय में मक्खियों के 4 जीनोटाइप तक इंजेक्ट करने के लिए, आयताकार सीओ 2 फ्लाई पैड को₄ वर्गों में विभाजित करने के लिए प्रयोगशाला टेप का उपयोग करें। माइक्रोस्कोप के पास बेंच पर, शीशियों को रखने के लिए नामित क्षेत्रों को एक बार मक्खियों को पैड पर लाइन में खड़ा किया गया है (पैड के प्रत्येक कोने के लिए एक)।
2. उम्र के मिलान की शीशियों को तैयार करें, 4-7 दिन पुरानी, इंजेक्शन के लिए मक्खियों। प्रत्येक तनाव का परीक्षण करने के लिए, 5 पुरुषों और 5 महिलाओं को तैयार फ्लाई फूड की एक ताजा, लेबल वाली शीशी में स्थानांतरित करें और 25 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
3. एक 100 एमएस (तरल को निष्कासित करने के लिए गैस दबाव के छोटे फटने - उप नैनोलीटर मात्रा के वितरण की अनुमति) TIMED मोड के लिए उपकरण स्थापित करके वायवीय इंजेक्टर (सामग्रीकी तालिका देखें) तैयार करें।
4. माइक्रोस्कोप स्लाइड तैयार करें। विद्युत टेप की 1.5 इंच स्ट्रिप्स काटें, चिपकने वाले पक्ष के साथ एक लूप में गुना करें, और एक लेबल वाले माइक्रोस्कोप स्लाइड पर रखें।

3. कांच केशिका सुई तैयार करें

1. सुई खींचने वाले का उपयोग करके कांच की सुई (पतली दीवार ग्लास केशिकाएं) खींचें।
   1. एक माइक्रोमीटर के साथ माइक्रोस्कोप के नीचे सुई पकड़ो और #5 ठीक बिंदु स्टेनलेस स्टील चिमटी का उपयोग कर टिप तोड़ । 100 माइक्रोन युक्तियां घायल को कम करते हुए फ्लाई के क्यूटिकल को छेदने के लिए पर्याप्त हैं।
   2. प्रत्येक फ्लाई में इंजेक्ट किए जाने वाले तरल की मात्रा को मापें। 1x PBS में बाँझ 5% खाद्य रंग के साथ सुई लोड और एक 0.01 मिमी चरण माइक्रोमीटर पर खनिज तेल की एक बूंद पर तरल निष्कासित।
      नोट: यदि तरल बूंद गोलाकार है, तो पिकाल्टर्स मेंमात्रा (आकार) 3/1910 के रूप में गणना की जाती है। 100 माइक्रोन व्यास वाली सुई 100 एमएस में ~ 2 एनएल को बाहर निकाल देगी।

4. मक्खियों को इंजेक्ट करें

1. पैराफिल्म के एक छोटे वर्ग पर 1.6 मिलीग्राम/एमएल कणों के पिपेट 10 माइक्रोन।
   1. सुई में तरल खींचो और इंजेक्टर नोजल में माउंट (सामग्री की मेजदेखें) ।
   2. एनेस्थेटाइज सीओ₂ के साथ मक्खियों और उन्हें फ्लाईपैड पर अपने निर्धारित क्षेत्र में लाइन, वेंट्रल साइड अप और पैड के सामने की ओर उन्मुख सिर के साथ। बेंच पर इसी क्षेत्रों में शीशियों रखें।
   3. 5, तरल के 100 एमएस पंप (~ 10 एनएल कुल) के साथ पेट के ऊपरी कोने पर मक्खियों को इंजेक्ट करते हैं।
   4. इंजेक्शन मक्खियों को उपयुक्त शीशियों में स्थानांतरित करें, शीशी पर समय पर ध्यान दें। 25 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
2. 0.4% ट्राइपैन ब्लू सॉल्यूशन के साथ एक नई सुई लोड करें।
3. गेटडीमें वायवीय इंजेक्टर सेट करें, जो हवा के निरंतर प्रवाह को सुई से तरल को धक्का देने की अनुमति देता है।
4. 30 मिनट तक विश्राम करने के बाद मक्खियों को एनेस्थेटाइज करें और Tryन ब्लू के साथ तब तक इंजेक्ट करें जब तक कि पेट भरा और डिटेन्ड न हो जाए।
   नोट: पीएच-संवेदनशील डाई के साथ लेबल किए गए कणों के साथ फागोसोम परिपक्वता की जांच करते समय, मक्खियों को 1 घंटे के लिए आराम करने की अनुमति दें और बढ़ते मक्खियों से पहले ट्राइपैन नीले रंग के साथ इंजेक्ट न करें।
5. माउंट विद्युत टेप, वेंट्रल साइड डाउन के साथ माइक्रोस्कोप स्लाइड पर उड़ता है। पंखों को फ्लाई के किनारे पर धकेलें और उन्हें टेप में सुरक्षित करें। इसके अलावा, धीरे-धीरे सिर को टेप में धकेल दें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि फ्लाई आगे नहीं बढ़ेगी।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5430-10 PicoNozzle Kit	World Precision Instruments	5430-10	Holder for 1.0mm pipette
E. coli (K-12 Strain) BioParticles, Fluorescein conjugate	Invitrogen	E2861	Killed E. coli labeled with FITC (Fluorescein). Use to test phagocyte recogntion and uptake of gram-negative bacteria. (~494/~518 nm)
Needle Pipette Puller	David Kopf Instruments	Model 725
Pneumatic PicoPump PV820	World Precision Instruments	SYS-PV820	The World Precision Instruments Pneumatic PicoPump PV820 uses differential pressures to hold liquid in the glass needle between injections. The user manually controls short bursts of gas pressure to expel the liquid – allowing delivery of sub-nanoliter volumes. The amount of liquid delivered depends on two main variables – the size of the glass needle opening and the amount of time injection pressure is applied. set the instrument to 100 ms "TIMED" mode.
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100F-3	Needles for injection. OD = 1.0 mm
Trypan Blue Solution (0.4%)	Sigma	T8154	Used to quench extracellular fluorescence of Fluorescein, Alexa Fluor, or Texas Red labeled particles.