Overview
这段视频描述了如何解剖和隔离成人 的Drosophila 大脑——这是可视化器官所必需的程序，否则被皮质层、眼睛和气管组织遮盖。示例协议显示了一个详细的演示，产生高质量的制剂，可用于免疫染色和成像方法在 嗜血 神经生物学。
Protocol
本协议摘自凯利等人.，解剖和免疫荧光染色蘑菇身体和光感受神经元在成人德罗索菲拉梅拉诺加斯特大脑，J.Vis.Exp.(2017).
1. 解剖站准备
- 将立体显微镜和光源与附加的光纤古塞内克放在一个大的台面上。为了促进手部的稳定动作，减少解剖时的手"抖动"，在显微镜周围必须有足够的手部和手臂休息空间。确保显微镜两侧约 8 - 10 英寸，显微镜底座和长凳边缘之间约 4 - 6 英寸。
- 用 1.0 毫升 PTN 缓冲液（0.1 M 磷酸钠缓冲液 pH 7.2、0.1% 非离子表面活性剂）填充 2 或 3 口玻璃 9 井或 3 井盘，参见 材料表 ，了解完整的缓冲组件），并放置在冰上解剖站旁边。新解剖的大脑将被转移到这道菜，并储存，直到固定步骤。
注： 如果需要实时成像，解剖缓冲器应为 1 倍磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 或 HL3 缓冲区。如果需要细胞内蛋白质本地化，PBS 也可以用作解剖和固定的替代缓冲器。固定后，应使用含有 0.1% 或 0.3% 非离子洗涤剂的 PTN 洗涤剂对细胞膜进行渗透。- 如果 PBS 用于解剖和固定，则应至少用含有洗涤剂的缓冲剂（如 PTN）冲洗一次移液器提示，以防止大脑在转移到微中流管时粘附在塑料移液器尖端上。
- 使用空的 35 毫米玻璃或塑料培养皿，构建包含硅胶弹性体的解剖盘。简言之，根据制造商的指示混合弹性体组件，倒入 35 mm 的菜肴中，使其在平坦的表面上聚合过夜。含有解剖盘的 Elastomer 应用于保护解剖钳子的精细提示，如果钳子与较硬的表面（如玻璃盘）接触，这些钳子很容易损坏。我们还定期从在线零售商处购买市售的硅胶涂层菜肴。为了在解剖过程中增加对比度，含有灭活木炭（因此为黑色）的硅胶弹性体解剖盘特别有用。
2. 成人脑切除程序
- 麻醉3 -5天大的成人 D.黑色素加斯特 与CO2 或使用冰。如果使用冰，将含有苍蝇的小瓶倒置（下插头）放入冰桶中约5分钟。将小瓶倒置成冰，防止苍蝇被卡在食物中。一旦苍蝇被麻醉，将苍蝇放在冰冷的金属垫或培养皿上，或放在排放二 氧化碳的飞垫上。如果解剖大脑来分析神经退化，老苍蝇也可能被使用。
- 使用转移移液器或 p200 移液器将少量 （150 - 200 μL） 的 PTN 放在解剖盘的中心，以创建 PTN 的"气泡"。将解剖盘放在立体显微镜下，调整照明和对焦，使PTN的气泡充满视野，并均匀照明。
- 操纵苍蝇，使它们"肚皮向上"（即腹侧向上），而躺在金属或CO2 垫。
- 使用一对#5钳，抓住苍蝇的腹部进行解剖，并抓住苍蝇，将其完全浸入解剖盘上的PTN中。
注： 对于协议的剩余部分，所有步骤都应在头被淹没在 PTN 中时执行。 - 使用第二对#5钳，抓住苍蝇的底座，将两对钳子拉开，将苍蝇头与身体分离。丢弃腹部和胸腔。在此步骤中，必须释放头部并允许漂浮在 PTN 表面。一旦头部漂浮，在不压碎大脑的情况下很难再次抓住。
注： 使用这种方法，大脑和心室神经线之间的连接被切断。如果需要在 CNS 的这些区域之间保持完整的连接，则应遵循替代解剖协议。如果在头部被移除之前，前体从苍蝇头上分离出来，就会有一个孔，其中的概率是。在这种情况下，抓住一只眼睛附近的孔边缘的苍蝇头。然后使用适量的力取出头部，同时将两对钳子彼此拉开。有时，当头部从身体中取出时，肠道和/或腹腔神经线仍然附着在头部，在继续解剖之前应将其切除。 - 当一对钳子抓住前臂时，第二对应该抓住右飞眼的中间边缘。慢慢地，把钳子拉开。这一步骤应以少量稳定的横向力执行。当钳子慢慢分开时，前体应该从头部拉开，在头部皮质层上形成一个中心孔。用第一对钳子丢弃前视镜，而不会从第二对钳子中释放右眼的中侧部分。
注： 成年 的D.梅拉诺加斯特 大脑在苍蝇头的考达尔（即后/后）区域。因此，应避免抓住头部的区域。理想情况下，只有靠近内膜视网膜的头部的罗斯特拉尔（即前部）部分应由钳子直接抓住。大脑和相关的气管现在应该通过基质层的中心孔可见。此时，任何从孔中伸出的白色细纹气管线都可以被移除和丢弃。 - 使用第二对钳子，抓住左骨网膜的内侧边缘（位于头部皮质层的中央孔边缘）。要去除视网膜和相关角质层，请以 180° 角缓慢地将钳子彼此拉开。当视网膜与底层视叶分离时，您应该会感到张力略有下降。缓慢地进行，以防止撕裂视叶。
注： 在此步骤中将钳子分离得太快可能导致视叶撕裂或蘑菇体结构中断。偶尔，皮质层将被移除，但视网膜的碎片将保持连接到视叶。如果成像蘑菇体，它不是完全必要的去除整个直膜。然而，对其他大脑区域（如视网膜神经元内侧的视网膜叶）的分析可能需要视网膜完全去除如所述。
注： 由于视网膜从大脑的底层视叶中慢慢分离，视叶应可观察到为覆盖着白色细长气管的不透明白色结构。一旦一个网膜被移除，它可以被丢弃。在分析视网膜神经元的路径探索时，应在此步骤中采取特别小心措施，以防止对视叶的损害。此外，还提供一项侧重于光感受神经元的解剖和实时成像的协议。 - 现在，小心地去除尽可能多的可见气管。气管可能已经含有或稍后充满空气，导致大脑漂浮，并可能在以后的免疫染色步骤中丢失。要去除气管，使用一对非常锋利的#5钳子将其从大脑中取出。
- 使用两对钳子抓住左飞网膜的内侧区域，去除剩余的网膜和周围的皮质层。小心地将小膜撕成两半，以去除网膜和皮质层的碎片。在某些情况下，在不压碎大脑的情况下去除剩余的皮质层尤其具有挑战性。在这些情况下，我们发现，心室神经线的剩余股可以由一对钳子抓住，而另一对钳子则用于小心地去除最后一个角质层。
- 使用 p200 移液器，将解剖的大脑移到含有 PTN 的 9 或 3 井盘中的一口井。同一基因型的大脑应该聚集在同一口井里，并保持在冰上。脑组织应在解剖后一小时内修复。大脑可以小批量固定，如果需要更多的大脑，可以集中。在大多数情况下，有经验的研究人员通常可以解剖大脑，并在大约3-5分钟内将其转移到玻璃收集盘。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microdissection forceps/tweezers | Ted Pella | 505-NM | |
| Sylgard dishes | Living Systems Instrumentation | DD-50-S-BLK | Available from amazon.com |
| Na Phosphate Buffer monobasic | Sigma | S3139 | |
| Triton X 100 | Sigma | X100-100ml | |
| stereomicroscope | Leica S6D with KL300 LED light source | ||
| 9-well dish (spot plate) | VWR | 89090-482 | |
| 35mm dish | Genesee Scientific | 32-103 | |
| Sylgard | Fisher | 50-366-794 | |
| Kimwipe | Fisher | 06-666 | |
| PTN Buffer | 0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, Typically make up 0.5 L of 0.1M NaPhosphate buffer and aliquote 50ml at a time as needed |
