드로소필라 성인 뇌 해부 : 비행 신경 생물학의 방법

Overview

이 비디오는 성인 Drosophila 두뇌를 해부하고 격리하는 방법을 설명합니다 - 그렇지 않으면 큐티클, 눈 및 기관 조직에 의해 가려지는 기관을 시각화하는 데 필요한 절차. 예제 프로토콜은 Drosophila 신경생물학에 있는 면역 염색 및 화상 진찰 방법에 사용될 수 있는 고품질 준비를 산출하는 상세한 데모를 보여줍니다.

Protocol

이 프로토콜은 켈리 외에서발췌 ., 해부 및 면역 형광 염색 버섯 몸과 성인 Drosophila 멜라노가스터 뇌에서 광수용체 뉴런의, J. Vis. Exp. (2017).

1. 해부 역 준비

1. 큰 벤치탑에 광섬유 구스넥이 부착된 스테레오현미경과 광원을 배치합니다. 꾸준한 손 움직임을 촉진하고 해부하는 동안 손 "흔들림"을 줄이기 위해서는 현미경 주위에 적절한 손과 팔 휴게 공간을 사용할 수 있습니다. 현미경의 양쪽에 약 8 - 10 인치와 현미경의 기저와 벤치 가장자리 사이에 4 - 6 인치가 있는지 확인하십시오.
2. PTN 버퍼 1.0mL(0.1M 인산염 버퍼 pH 7.2, 0.1% nonionic 계면활성제, 완전한 완충 성분을 위한 재료표 참조)로 유리 9웰 또는 3웰 접시의 2개 또는 3개의 우물을 채우고 얼음 위에 해부스테이션 옆에 놓습니다. 새로 해부 된 뇌는이 요리로 옮겨지고 고정 단계까지 저장됩니다.
   참고: 라이브 이미징이 필요한 경우 해부 버퍼는 1x 인산완충식식(PBS) 또는 HL3 버퍼여야 합니다. 세포 내 단백질 국소화가 필요한 경우 PBS는 해부 및 고정을위한 대체 버퍼로도 사용할 수 있습니다. 고정 후, 세포막의 투과화는 0.1% 또는 0.3% nonionic 세제를 포함하는 PTN 세지를 사용하여 수행되어야 합니다.
   1. PBS가 해부 및 고정에 사용되는 경우, 파이펫 팁은 뇌가 마이크로 센세이퍼튜브로 이송하는 동안 플라스틱 파이펫 팁에 달라붙지 않도록 세제 함유 버퍼(예: PTN)로 적어도 한 번 헹구어야 합니다.
3. 빈 35mm 유리 또는 플라스틱 페트리 접시를 사용하여 실리콘 엘라스토머가 들어있는 해부 접시를 생성합니다. 간단히 말해서 제조업체의 지시에 따라 탄성미 성분을 섞고 35mm 접시에 붓고 평평한 표면에서 밤새 중합하게 하십시오. 해부 접시를 함유한 엘라스토머는 집게와 유리 접시와 같이 더 단단한 표면 사이에 접촉하면 쉽게 손상될 수 있는 해부 집게의 미세한 팁을 보호하는 데 사용되어야 합니다. 우리는 또한 정기적으로 온라인 소매 업체에서 상용 실리콘 코팅 요리를 구입합니다. 해부 중 대비를 높이기 위해 불활성 탄탄(따라서 검은색)을 함유한 실리콘 탄성탄 해부 요리가 특히 유용합니다.

2. 성인 뇌 해부 절차

1. CO_2또는 얼음을 사용하여 3 - 5 일 된 성인 D. 멜라노가스터를 마취하십시오. 얼음을 사용하는 경우 파리가 들어있는 유리병을 거꾸로 놓습니다(끝까지 연결)를 얼음 양동이에 넣고 ~ 5분 동안 넣습니다. 유리병을 얼음에 거꾸로 놓는 것은 파리가 음식에 박혀있는 것을 방지합니다. 파리가 마취되면 얼음이나 CO₂ 방출 플라이 패드에 차가운 금속 패드 또는 페트리 접시에 파리를 놓습니다. 신경 변성을 분석 하기 위해 뇌를 해부 하는 경우, 이전 파리도 사용할 수 있습니다.
2. PTN의 "버블"을 만들기 위해 이송 파이펫 또는 p200 파이펫을 사용하여 해부 접시의 중앙에 PTN의 소량(150 -200 μL)을 놓습니다. 해부 접시를 스테레오현미경 아래에 놓고 조명과 초점을 조정하여 PTN의 거품이 시야를 채우고 균일하게 조명되도록 합니다.
3. 금속 또는 CO₂ 패드에 누워있는 동안 "배위로"(즉, 복부 측면 위로)되도록 파리를 조작합니다.
4. 한 쌍의 #5 집게를 사용하여 해부할 플라이의 복부를 잡고, 플라이를 잡고 해부 접시의 PTN에 완전히 침수하십시오.
   참고: 프로토콜의 나머지 부분에서는 머리가 PTN에 잠긴 동안 모든 단계를 수행해야 합니다.
5. 두 번째 #5 집게를 사용하여 플라이 프로보시스의 베이스를 잡고 두 쌍의 집게를 떼어 내어 몸에서 플라이 헤드를 분리합니다. 복부와 흉부를 버립니다. 이 단계에서는 헤드가 해제되지 않고 PTN의 표면에 떠있는 것이 중요합니다. 머리가 떠 있으면 뇌를 분쇄하지 않고 다시 파악하기가 매우 어려울 수 있습니다.
   참고: 이 방법을 사용하여 뇌와 복부 신경 코드 사이의 연결이 끊어지습니다. CNS의 이러한 영역 간의 그대로 연결이 필요한 경우 대체 해부 프로토콜을 따라야 합니다. 머리가 제거되기 전에 proboscis가 플라이 헤드에서 분리되면 프로보시스가 있던 구멍이 있을 것입니다. 이 경우 한쪽 눈 근처 구멍 의 가장자리에 플라이 헤드를 잡습니다. 그런 다음 두 쌍의 집게를 서로 떼어내면서 적당한 양의 힘을 사용하여 머리를 제거합니다. 때때로, 머리가 바디에서 제거될 때, 창자 및/또는 복부 신경 코드는 머리에 붙어 있고 해부를 계속하기 전에 제거되어야 합니다.
6. 한 쌍의 집게가 프로보시스를 파악하는 동안, 두 번째 쌍은 오른쪽 플라이 눈의 내측 가장자리를 파악해야합니다. 천천히, 서로 떨어져 집게를 당깁니다. 이 단계는 소량의 안정적인 측면 힘으로 수행해야 합니다. 집게가 서서히 서로 떨어져 움직이면, 프로보시스는 머리에서 벗어나 머리 표기에 중앙 구멍을 만들어야 합니다. 두 번째 쌍에서 오른쪽 눈의 내측 부분을 방출하지 않고 첫 번째 스포스로 proboscis를 폐기하십시오.
   참고: 성인 D. 멜라노가스터 뇌는 플라이 헤드의소달(즉,후방/후방) 부위에 있습니다. 따라서, 머리의 그 영역을 파악하는 것은 피해야한다. 이상적으로, 내측 망막근처의 머리의 로스트랄(즉, 앞) 부분만 집게에 의해 직접 파악되어야 한다. 뇌와 관련 기관들은 이제 큐티클의 중앙 구멍을 통해 볼 수 있습니다. 이 때 구멍에서 튀어나온 기관지의 흰색 구끈한 실을 제거하고 버릴 수 있습니다.
7. 두 번째 집게를 사용하면 왼쪽 망막의 내측 가장자리를 잡습니다(머리 표기장의 중앙 구멍 가장자리). 망막과 관련 큐티클을 제거하려면 180° 각도로 집게를 천천히 당깁니다. 망막이 기본 광학 엽에서 해리로, 당신은 긴장의 약간의 감소를 느껴야한다. 광학 엽을 찢는 것을 방지하기 위해 천천히 진행합니다.
   참고: 이 단계 동안 너무 빨리 집게를 분리하면 광학 엽이 찢어지거나 버섯 신체 구조가 중단될 수 있습니다. 때때로, 큐티클은 제거될 것입니다 그러나 망막의 조각은 광학 엽에 붙어 있을 것입니다. 버섯 시체를 이미징 하는 경우, 그것은 완전히 전체 망막을 제거 할 필요가 없습니다. 그러나, 다른 뇌 영역의 분석 (예 : 광학 뇌 엽의 망막 뉴런 내림) 망막에 의해 설명 된 대로 완전히 제거 될 필요가 있을 수 있습니다.
   참고: 망막이 뇌의 기본 광학 엽에서 서서히 분리되기 때문에, 광학 엽은 흰색, 끈적 끈적한 기관으로 덮여 불투명한 흰색 구조로 관찰 할 수 있어야합니다. 망막 하나가 제거되면 폐기 할 수 있습니다. 망막 뉴런의 경로 발견을 분석 할 때, 특히주의는 광학 엽에 손상을 방지하기 위해이 단계 동안 취해야한다. 광수용체 뉴런의 해부 및 라이브 이미징에 초점을 맞춘 추가 프로토콜도 사용할 수 있습니다.
8. 지금, 신중 하 게 가능한 한 눈에 보이는 기관의 많은 제거. 기관체는 이미 공기를 포함하거나 나중에 채울 수 있으며, 뇌가 떠다니게 하고, 잠재적으로 나중에 면역 염색 단계 중에 손실될 수 있습니다. 기관체를 제거하려면 매우 날카로운 #5 집게를 사용하여 뇌를 선택하십시오.
9. 왼쪽 플라이 망막의 내측 영역을 파악하기 위해 두 쌍의 집게를 사용하여 나머지 망막과 주변 표피를 제거합니다. 망막조각을 반으로 조심스럽게 찢어 망막과 표절조각을 제거합니다. 어떤 경우에는 뇌를 분쇄하지 않고 나머지 표피를 제거하는 것은 특히 어려운 증명. 이러한 경우에, 우리는 복부 신경 코드의 나머지 가닥 대신 집게의 한 쌍에 의해 파악 될 수 있다는 것을 발견한 반면, 다른 쌍의 집게는 조심스럽게 표피의 마지막을 제거하는 데 사용됩니다.
10. p200 파이펫을 사용하여 해부된 뇌를 PTN을 함유한 9웰 또는 3웰 접시 중 한 웰로 이동합니다. 같은 유전자형의 뇌는 같은 우물로 함께 풀과 얼음에 보관해야합니다. 뇌 조직은 해부의 한 시간 이내에 고정되어야한다. 두뇌는 작은 배치로 고정하고 두뇌의 더 많은 수가 필요한 경우에 풀링될 수 있습니다. 대부분의 상황에서 숙련 된 연구원은 일반적으로 뇌를 해부하고 약 3 - 5 분 안에 유리 수집 접시로 옮길 수 있습니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microdissection forceps/tweezers	Ted Pella	505-NM
Sylgard dishes	Living Systems Instrumentation	DD-50-S-BLK	Available from amazon.com
Na Phosphate Buffer monobasic	Sigma	S3139
Triton X 100	Sigma	X100-100ml
stereomicroscope	Leica S6D with KL300 LED light source
9-well dish (spot plate)	VWR	89090-482
35mm dish	Genesee Scientific	32-103
Sylgard	Fisher	50-366-794
Kimwipe	Fisher	06-666
PTN Buffer			0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, Typically make up 0.5 L of 0.1M NaPhosphate buffer and aliquote 50ml at a time as needed