ショウジョウバエ 成人脳解剖:フライ神経生物学における方法

Overview

このビデオでは、成人 のショウジョウバエ の脳を解剖して分離する方法について説明します – そうでなければキューティクル、目、気管組織によって隠されている臓器を視覚化するために必要な手順。このプロトコル例は、 ショウジョウバエ 神経生物学における免疫染色法およびイメージング法に使用できる高品質の製剤を得る詳細な実証を示す。

Protocol

このプロトコルは、ケリーら、成人ショウジョウバエメラノガスター脳におけるキノコ体および感光体の解剖および免疫蛍光染色、J.Vis. Expからの抜粋である。(2017).

1. 解剖ステーションの準備

1. 大きなベンチトップに、光ファイバーのグースネックが取り付けられた実体顕微鏡と光源を配置します。安定した手の動きを促進し、解剖しながら手の「振る」を減らすためには、顕微鏡の周りに十分な手と腕の休憩スペースが利用可能である必要があります。顕微鏡の両側に約8〜10インチ、顕微鏡のベースとベンチの端の間に4〜6インチがあることを確認します。
2. ガラス9ウェルまたは3ウェル皿の2または3ウェルの井戸を1.0 mLのPTNバッファー(0.1 Mリン酸緩衝液pH 7.2、0.1%非イオン界面活性剤)で満たし、完全な緩衝成分 については材料表 を参照してください)、氷上の解剖ステーションの隣に置きます。新たに解剖された脳は、この皿に移され、固定段階まで保存されます。
   注: ライブイメージングが必要な場合、解剖バッファーは1xリン酸緩衝生理食塩基(PBS)またはHL3バッファでなければなりません。細胞内タンパク質の局在化が必要な場合、PBSは、解剖および固定化のための代替バッファーとしても使用できます。固定後、細胞膜の透過性は、0.1%または0.3%の非イオン性洗剤を含むPTN洗浄を使用して行われるべきである。
   1. PBSを排液および固定に使用する場合、ピペットチップは、マイクロ遠心チューブへの転送中に脳がプラスチックピペットチップに付着するのを防ぐために、洗剤含有バッファー(PTNなど)で少なくとも1回リンスする必要があります。
3. 空の35mmガラスまたはプラスチックシャーレを使用して、シリコーンエラストマーを含む解剖皿を構築します。簡単に、メーカーの指示に従ってエラストマー成分を混合し、35ミリメートルの皿に注ぎ、平らな表面に一晩重合させます。解剖皿を含むエラストマーは、鉗子とガラス皿などの硬い表面との間に接触すると容易に損傷を受ける可能性のある鉗子の解剖の細かい先端を保護するために使用されるべきである。また、定期的にオンライン小売業者から市販のシリコーンコーティングされた料理を購入しています。解剖中のコントラストを高めるために、不活性炭(したがって黒色)を含むシリコーンエラストマー解剖皿は特に有用である。

2. 成人脳解剖手順

1. _CO2または氷を使用して3-5日齢の大人D.メラノガスターを麻酔します。氷を使用する場合は、ハエを含むバイアルを逆さま(プラグエンドダウン)してアイスバケツに入れ、約5分間置きます。バイアルを逆さまに氷に入れることで、ハエが食べ物に宿るのを防ぎます。ハエが麻酔されたら、氷の中に座っている冷たい金属パッドやシャーレの上にハエを置くか、またはCO₂放出フライパッドの上に置きます。神経変性を分析するために脳を解剖する場合は、古いハエも使用される可能性があります。
2. トランスファーピペットまたはp200ピペットを使用して、少量(150〜200 μL)のPTNを切除皿の中央に入れ、PTNの「バブル」を作ります。解剖皿を実体顕微鏡下に置き、PTNの泡が視野を満たし、均一に照らされるように照明と焦点を調整します。
3. 金属や_CO2パッドに横たわっている間にハエを操作して「腹を立てる」(腹側を上にして)します。
4. 1組の#5鉗子を使用して、解剖されるハエの腹部をつかみ、ハエを保持し、解剖皿のPTNに完全に沈める。
   注: プロトコルの残りの部分では、ヘッドが PTN に沈んでいる間に、すべてのステップを実行する必要があります。
5. 2番目の#5鉗子を使用して、フライプロボシスのベースをつかみ、2組の鉗子を引き離してフライヘッドをボディから取り外します。腹部と胸部を捨てます。このステップの間に、頭部が解放されず、PTNの表面に浮動することが許されないことが重要である。頭が浮かんだら、脳を押しつぶさずに再びつかむのは非常に難しい場合があります。
   注: この方法を使用して、脳と腹側神経コードの間の接続が切断されます。CNS のこれらの領域間の接続が不一定である場合は、別の解剖プロトコルに従う必要があります。頭部が取り外される前にフライヘッドから切り離された場合、プロボシスがあった穴が開きます。この場合、片目付近の穴の端でフライヘッドをつかんで下さいます。次に、適度な力で頭部を取り除き、2組の鉗子を互いに引き離します。時折、頭部が身体から取り除かれると、腸および/または腹側神経コードは頭部に付着したままであり、解剖を続ける前に取り除くべきである。
6. 1組の鉗子がプロボシスを把握している間、2番目のペアは右のフライアイの内側の端をつかむべきである。ゆっくりと、鉗子を互いに引き離します。このステップは、少し安定した横力で実行する必要があります。鉗子がゆっくりと互いに離れて移動すると、プロボシスは頭から引き離し、頭のキューティクルに中央の穴を作る必要があります。2番目のペアから右目の内側部分を離さずに、最初の鉗子でプロボシスを捨てます。
   注: D. メラノガスター の脳は、ハエヘッドの尾側(すなわち、後部/後部)領域にある。したがって、頭の領域を把握することは避けるべきです。理想的には、内側のレチナの近くの頭部のロストラル(すなわち、前部)部分だけが鉗子によって直接つかまされるべきである。脳と関連気管は、キューティクルの中央の穴を通して見えるようになりました。このとき、穴から突き出た気管の白い糸糸を取り除いて捨てることができます。
7. 鉗子の第2のペアで、左の口内の内側の端をつかむ(頭部キューティクルの中央の穴の端にある)。レチナと関連するキューティクルを取り除くために、ゆっくりと180°の角度で互いから鉗子を引き離します。その下にある視葉から離離して、筋緊張がわずかに低下するはずです。光ローブを引き裂くのを防ぐためにゆっくりと進みます。
   注: このステップ中に鉗子をあまりにも速く分離すると、視神経の引き裂きやキノコの体構造の破壊が生じる可能性があります。時折、キューティクルは取り除かれますが、レチナの破片は光学ローブに取り付けられたままになります。キノコの体をイメージングする場合は、完全に全体の残りの残りの体を除去する必要はありません。しかし、他の脳領域(視神経神経の神経内臓の視神経など)の分析は、次に述べたように完全に除去される必要がある。
   注: レチナは脳の下にある視神経からゆっくりと分離するので、光学的なローブは白い糸状気管で覆われた不透明な白い構造として観察可能であるべきです。1 つのレティナが削除されると、それを破棄できます。網膜神経細胞の経路探索を分析する場合、このステップでは、視神経への損傷を防ぐために特に注意が必要です。感光体ニューロンの解剖およびライブイメージングに焦点を当てた追加のプロトコルも利用可能である。
8. 今、慎重に可能な限り目に見える気管の多くを削除します。気管はすでに空気を含んでいるか、後で満たされ、脳が浮き上がり、後の免疫染色ステップ中に失われる可能性があります。気管を取り除くために、#5鉗子の非常に鋭いペアを使用して脳からそれを取り除きます。
9. 両鉗子を使用して、左フライレティナの内側領域を把握することによって、残りのレチナと周囲のキューティクルを取り除きます。慎重にレチナを半分に引き裂き、レチナとキューティクルの破片を取り除きます。場合によっては、脳を押しつぶすことなく残りのキューティクルを取り除くことは特に困難であることが証明されます。これらのケースでは、腹側神経コードの残りのストランドは、代わりに1組の鉗子で把握することができ、他の鉗子のペアは慎重にキューティクルの最後を取り除くために使用されることがわかりました。
10. p200ピペットを使用して、解剖された脳をPTNを含む9または3ウェル皿の1つの井戸に移動する。同じ遺伝子型の脳は、同じ井戸に一緒にプールし、氷の上に保たれるべきです。脳組織は、解剖の1時間以内に固定する必要があります.脳の数が多い場合は、脳を小さなバッチで固定し、プールすることができます。ほとんどの状況では、経験豊富な研究者は通常、脳を解剖し、約3〜5分でガラスコレクション皿に移すことができます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microdissection forceps/tweezers	Ted Pella	505-NM
Sylgard dishes	Living Systems Instrumentation	DD-50-S-BLK	Available from amazon.com
Na Phosphate Buffer monobasic	Sigma	S3139
Triton X 100	Sigma	X100-100ml
stereomicroscope	Leica S6D with KL300 LED light source
9-well dish (spot plate)	VWR	89090-482
35mm dish	Genesee Scientific	32-103
Sylgard	Fisher	50-366-794
Kimwipe	Fisher	06-666
PTN Buffer			0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, Typically make up 0.5 L of 0.1M NaPhosphate buffer and aliquote 50ml at a time as needed