Drosophila Dissecção cerebral adulta: um método em neurobiologia de moscas

Overview

Este vídeo descreve como dissecar e isolar o cérebro de Drosophila adulto – um procedimento necessário para visualizar o órgão, que é obscurecido de outra forma pela cutícula, olho e tecido traqueal. O protocolo de exemplo mostra uma demonstração detalhada produzindo preparações de alta qualidade que podem ser usadas para métodos de imunossuagem e imagem na neurobiologia de Drosophila.

Protocol

Este protocolo é um trecho de Kelly et al., Dissecção e Coloração Imunofluorescente de Corpo de Cogumelo e Neurônios Fotorreceptores em Cérebros melanogaster drosophila adulto, J. Vis. Exp. (2017).

1. Preparação da Estação de Dissecção

1. Posicione o estereómicrocópio e a fonte de luz com gansos de fibra óptica ligados em um grande banco. Para promover movimentos constantes das mãos e reduzir o "aperto" da mão durante a dissecação, é essencial que o espaço adequado de descanso de mãos e braços esteja disponível ao redor do microscópio. Certifique-se de que há aproximadamente 8 - 10 polegadas em ambos os lados do microscópio e 4 - 6 polegadas entre a base do microscópio e a borda do banco.
2. Encha 2 ou 3 poços de um copo de 9-bem ou 3-well prato com 1,0 mL de tampão PTN (0,1 M Tampão de Fosfato de Sódio pH 7.2, 0,1% surfactante noniônico, consulte Tabela de Materiais para componentes tampão completo) e coloque ao lado da estação de dissecação no gelo. Cérebros recém-dissecados serão transferidos para este prato e armazenados até a etapa de fixação.
   NOTA: Se for necessária uma imagem viva, o buffer de dissecção deve ser 1x Phosphate Buffered Saline (PBS) ou HL3 buffer. Se for necessária a localização de proteína intracelular, o PBS também pode ser usado como um tampão alternativo para dissecção e fixação. Após a fixação, a permeabilização das membranas celulares deve então ser realizada utilizando lavagens PTN contendo 0,1% ou 0,3% de detergente noniônico.
   1. Se o PBS for usado para dissecções e fixação, as pontas de pipeta devem ser enxaguadas pelo menos uma vez com um buffer contendo detergente (como PTN) para evitar que os cérebros grudem nas pontas de pipeta plástica durante a transferência para tubos de microcentrifuuge.
3. Usando um copo vazio de 35 mm ou placa de petri de plástico, construa uma placa de dissecção contendo um elastômero de silicone. Brevemente, misture os componentes do elastômero de acordo com as instruções do fabricante, despeje em pratos de 35 mm e deixe polimerizar durante a noite em uma superfície plana. O destomer contendo pratos de dissecção deve ser usado para proteger as finas pontas de dissecação de fórceps, que podem ser facilmente danificadas se o contato for feito entre as fórceps e uma superfície mais dura, como um prato de vidro. Também compramos regularmente pratos revestidos de silicone disponíveis comercialmente de varejistas online. Para aumentar o contraste durante as dissecções, os pratos de dissecção de elastômero de silicone contendo carvão inativado (e, portanto, preto colorido) são particularmente úteis.

2. Procedimento de Dissecção cerebral adulta

1. Anestesiar 3 - 5 dias de idade adulto D. melanogaster com CO₂ ou usando gelo. Se usar gelo, coloque o frasco contendo moscas de cabeça para baixo (tampe a ponta para baixo) em um balde de gelo por ~5 min. Colocar o frasco no gelo de cabeça para baixo evita que as moscas fiquem alojadas na comida. Uma vez que as moscas tenham sido anestesiadas, coloque as moscas em uma almofada de metal frio ou placa de petri sentada no gelo ou em uma plataforma de voo emissora de CO_2. Se dissecar cérebros para analisar a neurodegeneração, moscas mais velhas também podem ser usadas.
2. Coloque uma pequena quantidade (150 - 200 μL) de PTN no centro da folha de dissecção usando uma pipeta de transferência ou uma pipeta p200 para criar uma "bolha" de PTN. Coloque o prato de dissecção sob o estereómico e ajuste a iluminação e o foco para que a bolha de PTN preencha o campo de visão e seja uniformemente iluminada.
3. Manipule as moscas de modo que elas sejam "barriga para cima"(ou seja,lado ventral para cima) enquanto estão deitadas no metal ou co₂ pad.
4. Usando um par de #5 fórceps, segure o abdômen de uma mosca para ser dissecado e, mantendo-se a segurando a mosca, submerga-a completamente no PTN no prato de dissecção.
   NOTA: Para o restante do protocolo, todas as etapas devem ser executadas enquanto a cabeça estiver submersa em PTN.
5. Usando um segundo par de fórceps #5, segure a base da mosca proboscis e puxe os dois pares de fórceps separados para separar a cabeça de mosca do corpo. Descarte o abdômen e o tórax. Durante esta etapa, é fundamental que a cabeça não seja solta e permitida a flutuar na superfície do PTN. Uma vez que a cabeça está flutuando, pode ser muito difícil de entender novamente sem esmagar o cérebro.
   NOTA: Usando este método, as conexões entre o cérebro e o fio do nervo ventral são cortadas. Se forem necessárias conexões intactas entre essas regiões do CNS, um protocolo alternativo de dissecção deve ser seguido. Se o proboscis se desprender da cabeça antes da cabeça ser removida, haverá um buraco onde o proboscis estava. Neste caso, segure a cabeça de mosca na borda do buraco perto de um olho. Em seguida, remova a cabeça usando uma quantidade moderada de força enquanto puxa os dois pares de fórceps separados um do outro. Ocasionalmente, quando a cabeça é removida do corpo, o intestino e/ou o fio nervoso ventral permanecem presos à cabeça e devem ser removidos antes de continuar a dissecção.
6. Enquanto um par de fórceps agarra o proboscis, o segundo par deve agarrar a borda medial do olho de mosca direito. Lentamente, puxe os fórceps um do outro. Esta etapa deve ser realizada com uma pequena quantidade de força lateral constante. À medida que os fórceps se afastam lentamente um do outro, os proboscis devem se afastar da cabeça e criar um buraco central na cutícula da cabeça. Descarte o proboscis com o primeiro par de fórceps sem liberar a porção medial do olho direito do segundo par.
   NOTA: O cérebro de D. melanogaster adulto está na região caudal(ou seja,posterior/traseira) da cabeça de mosca. Assim, deve-se evitar a preensão dessa região da cabeça. Idealmente, apenas a parte rostral (ou seja,frontal) da cabeça perto da retina medial deve ser diretamente agarrada pelos fórceps. O cérebro e a traqueia associada devem agora ser visíveis através do buraco central da cutícula. Neste momento, qualquer fio branco de traqueia salientes do orifício pode ser removido e descartado.
7. Com o segundo par de fórceps, segure a borda medial da retina esquerda (na borda do orifício central na cutícula da cabeça). Para remover as retinas e cutícula associada, puxe lentamente os fórceps um do outro em um ângulo de 180°. À medida que a retina se dissocia do lobo óptico subjacente, você deve sentir uma ligeira diminuição da tensão. Prossiga lentamente para evitar rasgar o lobo óptico.
   NOTA: Separar os fórceps muito rapidamente durante esta etapa pode resultar no rasgo do lobo óptico ou na interrupção das estruturas do corpo dos cogumelos. Ocasionalmente, a cutícula será removida, mas pedaços da retina permanecerão presos ao lobo óptico. Se a imagem dos corpos dos cogumelos, não é completamente necessário remover toda a retina. No entanto, a análise de outras regiões cerebrais (como a inervação do neurônio retiniano dos lobos cerebrais ópticos) pode exigir que a retina seja completamente removida como descrito por.
   NOTA: Como a retina é lentamente separada do lobo óptico subjacente do cérebro, o lobo óptico deve ser observável como uma estrutura branca opaca coberta com traqueia branca e pegajosa. Uma vez que uma retina tenha sido removida, ela pode ser descartada. Ao analisar o pathfinding dos neurônios da retina, deve-se tomar cuidado especial durante esta etapa para evitar danos ao lobo óptico. Um protocolo adicional focado em dissecção e imagem ao vivo dos neurônios fotorreceptor também está disponível.
8. Agora, remova cuidadosamente o máximo possível da traqueia visível. A traqueia já pode conter ou depois encher de ar, fazendo com que os cérebros flutuem e, potencialmente, se percam durante etapas posteriores de imunossuagem. Para remover a traqueia, retire-a do cérebro usando um par muito afiado de #5 fórceps.
9. Remova a retina restante e a cutícula circundante usando ambos os pares de fórceps para agarrar a região medial da retina da mosca esquerda. Rasgue cuidadosamente a retina ao meio para remover pedaços da retina e cutícula. Em alguns casos, remover a cutícula restante sem esmagar o cérebro é especialmente desafiador. Nestes casos, descobrimos que os fios restantes do fio nervoso ventral podem, em vez disso, ser agarrados por um par de fórceps, enquanto o outro par de fórceps é usado para remover cuidadosamente o último da cutícula.
10. Usando uma pipeta p200, mova cérebros dissecados para um poço do prato de 9 ou 3 poços contendo PTN. Cérebros do mesmo genótipo devem ser agrupados no mesmo poço e mantidos no gelo. O tecido cerebral deve ser consertado dentro de uma hora de dissecção. Cérebros podem ser fixados em pequenos lotes e agrupados se um número maior de cérebros for necessário. Na maioria das circunstâncias, um pesquisador experiente geralmente pode dissecar um cérebro e transferi-lo para o prato de coleta de vidro em aproximadamente 3 - 5 min.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microdissection forceps/tweezers	Ted Pella	505-NM
Sylgard dishes	Living Systems Instrumentation	DD-50-S-BLK	Available from amazon.com
Na Phosphate Buffer monobasic	Sigma	S3139
Triton X 100	Sigma	X100-100ml
stereomicroscope	Leica S6D with KL300 LED light source
9-well dish (spot plate)	VWR	89090-482
35mm dish	Genesee Scientific	32-103
Sylgard	Fisher	50-366-794
Kimwipe	Fisher	06-666
PTN Buffer			0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, Typically make up 0.5 L of 0.1M NaPhosphate buffer and aliquote 50ml at a time as needed