Drosophila Voksen Brain Dissektion: En metode i Fly Neurobiologi

Overview

Denne video beskriver, hvordan man dissekere og isolere den voksne Drosophila hjerne-en procedure, der er nødvendig for at visualisere organet, som ellers er skjult af kutikula, øje, og luftrør væv. Eksempelprotokollen viser en detaljeret demonstration, der giver præparater af høj kvalitet, der kan bruges til immunostaining og billeddannelsesmetoder i Drosophila neurobiologi.

Protocol

Denne protokol er et uddrag fra Kelly et al., Dissektion og Immunofluorescent Farvning af Mushroom Body og Photoreceptor Neurons i Adult Drosophila melanogaster Brains, J. Vis. Exp. (2017).

1. Forberedelse af dissektionsstation

1. Placer stereomikroskopet og lyskilden med tilhørende fiberoptiske gåsehud på en stor bordplade. For at fremme rolige håndbevægelser og reducere hånd "ryste", mens dissekere, er det vigtigt, at tilstrækkelig hånd og arm hvile plads er tilgængelig omkring mikroskopet. Sørg for, at der er ca 8 - 10 inches på hver side af mikroskopet og 4 - 6 inches mellem bunden af mikroskop og kanten af bænken.
2. Fyld 2 eller 3 brønde af et glas 9-brønds eller 3-brønds skål med 1,0 mL PTN buffer (0,1 M Natriumphosphat Buffer pH 7,2, 0,1% nonionisk overfladeaktivt middel, se Materialetabel for komplette bufferkomponenter) og læg ved siden af dissekeringsstationen på is. Nyligt dissekeret hjerner vil blive overført til denne parabol og opbevares indtil fiksering trin.
   BEMÆRK: Hvis der kræves levende billeddannelse, skal dissektionsbufferen være 1x fosfatbuffer (PBS) eller HL3-buffer. Hvis intracellulær proteinlokalisering er påkrævet, kan PBS også bruges som en alternativ buffer til dissektion og fiksering. Efter fiksering skal permeabilisering af cellemembraner derefter udføres ved hjælp af PTN-vaske, der indeholder 0,1% eller 0,3% nonionisk vaskemiddel.
   1. Hvis PBS anvendes til dissektioner og fiksering, skal pipettespidserne skylles mindst én gang med en vaskemiddelholdig buffer (f.eks.
3. Ved hjælp af en tom 35 mm glas eller plast petriskål, konstruere en dissektion fad, der indeholder en silikone elastomer. Bland kort elastomerkomponenterne i henhold til producentens anvisninger, hæld i 35 mm retter, og lad det polymerisere natten over på en flad overflade. Elastomer indeholdende dissektionsretter bør bruges til at beskytte de fine spidser af dissekerende pincet, som let kan beskadiges, hvis der er kontakt mellem tangen og en hårdere overflade, såsom en glasskål. Vi køber også regelmæssigt kommercielt tilgængelige silikonebelagte retter fra onlineforhandlere. For at øge kontrasten under dissektioner er silikoneeelastomerdissektionsretter, der indeholder inaktiveret trækul (og dermed farvet sort), særligt nyttige.

2. Voksen Brain Dissektion Procedure

1. Bedøve 3 - 5 dage gamle voksne D. melanogaster med CO₂ eller ved hjælp af is. Hvis du bruger is, skal du placere hætteglasset, der indeholder fluer på hovedet (stikket slutter ned) i en isspand i ~ 5 min. Placering af hætteglasset i is på hovedet forhindrer fluer i at blive indgivet i maden. Når fluerne er blevet bedøvet, skal du placere fluerne på en kold metalpude eller petriskål, der sidder i is eller på en CO_2-udsendende fluepude. Hvis dissekere hjerner til at analysere neurodegeneration, ældre fluer kan også anvendes.
2. Placer en lille mængde (150 - 200 μL) PTN i midten af dissektionsskålen ved hjælp af en overførselspipette eller en p200 pipette for at skabe en "boble" af PTN. Placer dissektionsskålen under stereomikroskopet, og juster belysningen og fokus, så PTN-boblen fylder synsfeltet og er ensartet belyst.
3. Manipulere fluer, så de er "mave op"(dvs.,ventral side op), mens liggende på metal eller CO₂ pad.
4. Ved hjælp af et par #5 pincet, forstå maven af en flue, der skal dissekeres, og holde fat i fluen, helt nedsænke det i PTN på dissektion parabol.
   BEMÆRK: For resten af protokollen skal alle trin udføres, mens hovedet er nedsænket i PTN.
5. Brug et andet par #5 pincet, tag fat i bunden af flue proboscis og træk de to par pincet fra hinanden for at løsne fluehovedet fra kroppen. Kassér maven og brystkassen. I løbet af dette trin er det afgørende, at hovedet ikke frigives og får lov til at flyde på overfladen af PTN. Når hovedet flyder, kan det være meget svært at forstå igen uden at knuse hjernen.
   BEMÆRK: Ved hjælp af denne metode, forbindelser mellem hjernen og ventral nerve ledningen er afskåret. Hvis der er behov for intakte forbindelser mellem disse regioner i CNS, bør der følges en alternativ dissektionsprotokol. Hvis proboscis løsner sig fra fluehovedet, før hovedet fjernes, vil der være et hul, hvor proboscis var. I dette tilfælde skal du gribe fluehovedet ved kanten af hullet nær det ene øje. Fjern derefter hovedet ved hjælp af en moderat mængde kraft, mens du trækker de to par pincet fra hinanden. Lejlighedsvis, når hovedet er fjernet fra kroppen, tarmen og / eller ventral nerve ledningen forbliver fastgjort til hovedet og bør fjernes, før du fortsætter dissektion.
6. Mens et par pincet griber proboscis, bør det andet par forstå den mediale kant af højre flue øje. Træk langsomt tangen fra hinanden. Dette trin skal udføres med en lille mængde stabil lateral kraft. Da tangen langsomt bevæger sig fra hinanden, skal proboscis trække sig væk fra hovedet og skabe et centralt hul i hovedets neglebånd. Kassér proboscis med det første par pincet uden at frigive den mediale del af højre øje fra det andet par.
   BEMÆRK: Den voksne D. melanogaster hjerne er i kaudale(dvs.posterior / bageste) region af fluehovedet. Således bør forstå, at regionen af hovedet undgås. Ideelt set bør kun rostral(dvs.front) del af hovedet nær mediale nethinden være direkte greb af pincet. Hjernen og tilhørende luftrør skal nu være synlige gennem det centrale hul i neglebåndet. På dette tidspunkt kan alle hvide trævlede tråde af luftrør, der stikker ud fra hullet, fjernes og kasseres.
7. Med det andet par pincet, forstå mediale kanten af venstre nethinden (på kanten af det centrale hul i hovedet kutikula). For at fjerne nethinden og den tilhørende kutikula skal du langsomt trække tangen væk fra hinanden i en 180° vinkel. Da nethinden tager afstand fra den underliggende optiske lap, bør du føle et lille fald i spændingen. Fortsæt langsomt for at forhindre, at den optiske lap rives i stykker.
   BEMÆRK: Adskillelse af pincet for hurtigt i løbet af dette trin kan resultere i rive af den optiske lap eller forstyrrelse af champignon kropsstrukturer. Lejlighedsvis vil neglebåndet blive fjernet, men stykker af nethinden forbliver fastgjort til den optiske lap. Hvis du tager billeddannelse af svampekroppene, er det ikke helt nødvendigt at fjerne hele nethinden. Men, analyse af andre hjerne regioner (såsom nethinde neuron innervation af den optiske hjerneflipper) kan kræve nethinden, der skal fjernes helt som beskrevet af.
   BEMÆRK: Da nethinden langsomt adskilles fra hjernens underliggende optiske lap, skal den optiske lap kunne observeres som en uigennemsigtig hvid struktur dækket af hvid, trævlet luftrør. Når en nethinde er blevet fjernet, kan den kasseres. Ved analyse af pathfinding af nethindeneuroner skal der udvises særlig omhu under dette trin for at forhindre skader på den optiske lap. En ekstra protokol med fokus på dissektion og live billeddannelse af fotoreceptor neuroner er også tilgængelig.
8. Fjern nu forsigtigt så meget af den synlige luftrør som muligt. Luftrøret kan allerede indeholde eller senere fyldes med luft, forårsager hjerner til at flyde og potentielt gå tabt under senere immunfarvning trin. For at fjerne luftrør, skal du vælge det fra hjernen ved hjælp af et meget skarpt par #5 pincet.
9. Fjern den resterende nethinde og omgivende kutikula ved at bruge begge par pincet til at forstå den mediale region i venstre flue nethinden. Riv forsigtigt nethinden i halve for at fjerne stykker af nethinden og neglebåndet. I nogle tilfælde, fjerne de resterende kutikula uden at knuse hjernen viser sig særligt udfordrende. I disse tilfælde har vi konstateret, at de resterende tråde i ventral nerveledningen i stedet kan gribes af et par pincet, mens det andet par pincet bruges til omhyggeligt at fjerne den sidste af neglebåndet.
10. Brug en p200 pipette, flytte dissekeret hjerner til en brønd af 9- eller 3-brønds skålen, der indeholder PTN. Hjerner af samme genotype bør samles i samme brønd og holdes på is. Hjernevæv bør fastsættes inden for en time efter dissektion. Hjerner kan fastsættes i små partier og samles, hvis et større antal hjerner er påkrævet. I de fleste tilfælde kan en erfaren forsker normalt dissekere en hjerne og overføre den til glasopsamlingsskålen på ca. 3 - 5 minutter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microdissection forceps/tweezers	Ted Pella	505-NM
Sylgard dishes	Living Systems Instrumentation	DD-50-S-BLK	Available from amazon.com
Na Phosphate Buffer monobasic	Sigma	S3139
Triton X 100	Sigma	X100-100ml
stereomicroscope	Leica S6D with KL300 LED light source
9-well dish (spot plate)	VWR	89090-482
35mm dish	Genesee Scientific	32-103
Sylgard	Fisher	50-366-794
Kimwipe	Fisher	06-666
PTN Buffer			0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, Typically make up 0.5 L of 0.1M NaPhosphate buffer and aliquote 50ml at a time as needed