Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Encyclopedia of Experiments

Drosophila Yetişkin Beyin Diseksiyonu: Sinek Nörobiyolojisinde Bir Yöntem

Overview

Bu video, kütikül, göz ve trakeal doku tarafından gizlenen organı görselleştirmek için gerekli bir prosedür olan yetişkin Drosophila beyninin nasıl kesilip izole edildiğini açıklar. Örnek protokol, Drosophila nörobiyolojisinde immünostaining ve görüntüleme yöntemleri için kullanılabilecek yüksek kaliteli preparatlar sağlayan ayrıntılı bir gösteri göstermektedir.

Protocol

Bu protokol Kelly ve ark.,Mantar Vücudunun Diseksiyonu ve İmmünofluoresan Lekeleme ve Yetişkin Drosophila melanogaster Beyinlerde Fotoreceptör Nöronları, J. Vis. Exp'tenbir alıntıdır. (2017).

1. Diseksiyon İstasyonu Hazırlama

  1. Stereomikroskop ve ışık kaynağını ekli fiber optik kaz tüyü ile büyük bir tezgah üzerine yerleştirin. Sabit el hareketlerini teşvik etmek ve parçalarken el "titremesini" azaltmak için mikroskop etrafında yeterli el ve kol dinlenme alanının mevcut olması önemlidir. Mikroskobun her iki tarafında yaklaşık 8 - 10 inç ve mikroskop tabanı ile tezgahın kenarı arasında 4 - 6 inç olduğundan emin olun.
  2. Bir cam 9 kuyu veya 3 kuyu kabının 2 veya 3 kuyusunu 1,0 mL PTN tamponu ile doldurun (0,1 M Sodyum Fosfat Tampon pH 7,2, % 0,1 noyonik yüzey aktif madde, tam tampon bileşenleri için Malzeme Masası'na bakın) ve buz üzerindeki diseksiyon istasyonunun yanına yerleştirin. Yeni parçalanmış beyinler bu yemeğe aktarılacak ve fiksasyon adımına kadar saklanacaktır.
    NOT: Canlı görüntüleme gerekiyorsa, diseksiyon tamponu 1x Fosfat Tamponlu Salin (PBS) veya HL3 arabelleği olmalıdır. Hücre içi protein lokalizasyonu gerekiyorsa, PBS diseksiyon ve fiksasyon için alternatif bir tampon olarak da kullanılabilir. Fiksasyondan sonra, hücre zarlarının permeabilizasyonu daha sonra% 0.1 veya% 0.3 noniyonik deterjan içeren PTN yıkamaları kullanılarak yapılmalıdır.
    1. PBS diseksiyon ve fiksasyon için kullanılıyorsa, pipet uçları, beyinlerin mikrosantrifüj tüplerine transfer sırasında plastik pipet uçlarına yapışmasını önlemek için deterjan içeren bir tamponla (PTN gibi) en az bir kez durulanmalıdır.
  3. Boş bir 35 mm cam veya plastik petri kabı kullanarak, silikon elastomer içeren bir diseksiyon kabı inşa edin. Kısaca, elastomer bileşenlerini üreticinin talimatlarına göre karıştırın, 35 mm'lik tabaklara dökün ve düz bir yüzeyde gece boyunca polimerize olmasını bırakın. Diseksiyon yemekleri içeren elastomer,ps ile cam tabak gibi daha sert bir yüzey arasında temas edilirse kolayca hasar görebilen ince diseksiyon uçlarını korumak için kullanılmalıdır. Ayrıca, çevrimiçi perakendecilerden düzenli olarak piyasada bulunan silikon kaplı yemekler satın alıyoruz. Diseksiyonlar sırasında kontrastı artırmak için, inaktive kömür (ve dolayısıyla renkli siyah) içeren silikon elastomer diseksiyon yemekleri özellikle yararlıdır.

2. Yetişkin Beyin Diseksiyon Prosedürü

  1. CO2 ile veya buz kullanarak 3 - 5 günlük yetişkin D. melanogaster anestezi. Buz kullanıyorsanız, sinek içeren şişeyi baş aşağı (fiş ucu aşağı) ~5 dakika boyunca bir buz kovasına yerleştirin. Şişeyi baş aşağı buza yerleştirmek sineklerin yemeğe saplanmasını önler. Sinekler uyuşturulduktan sonra, sinekleri buzda oturan soğuk metal bir ped veya petri kabına veya CO2 yayan bir sineklik üzerine yerleştirin. Nörodejenerasyonu analiz etmek için beyinleri parçalıyorsanız, yaşlı sinekler de kullanılabilir.
  2. Bir PTN "kabarcığı" oluşturmak için bir transfer pipet veya p200 pipet kullanarak diseksiyon kabının ortasına az miktarda (150 - 200 μL) PTN yerleştirin. Diseksiyon kabını stereomikroskopun altına yerleştirin ve aydınlatmayı ve odağı PTN baloncuğu görüş alanını dolduracak ve düzgün bir şekilde aydınlatacak şekilde ayarlayın.
  3. Sinekleri, metal veya CO2 ped üzerinde yatarken "göbek yukarı"(yani,ventral taraf yukarı) olacak şekilde manipüle edin.
  4. Bir çift #5 toka kullanarak, parçalanacak bir sineğin karnını kavrayın ve sineği tutarak, diseksiyon kabındaki PTN'ye tamamen batırın.
    NOT: Protokolün geri kalanı için, kafa PTN'ye batırılırken tüm adımlar gerçekleştirilmelidir.
  5. İkinci bir çift #5 proboscis kullanarak, sinek hortumunun tabanını kavrayın ve sinek kafasını vücuttan ayırmak için iki çift kuvveti ayırın. Karın ve toraksı atın. Bu adım sırasında, başın serbest bırakılmaması ve PTN yüzeyinde yüzmesine izin verilmesi kritik öneme sahiptir. Kafa yüzdöndürüldkten sonra, beyni ezmeden tekrar kavramak çok zor olabilir.
    NOT: Bu yöntem kullanılarak beyin ve ventral sinir kordonu arasındaki bağlantılar kopar. CNS'nin bu bölgeleri arasında sağlam bağlantılar gerekiyorsa, alternatif bir diseksiyon protokolü takip edilmelidir. Kafa çıkarılmadan önce hortum sinek kafasından ayrılırsa, hortumun olduğu yerde bir delik olacaktır. Bu durumda, sinek kafasını bir gözün yanındaki deliğin kenarında kavrayın. Daha sonra iki çift kuvveti birbirinden ayırırken orta miktarda kuvvet kullanarak başı çıkarın. Bazen, kafa vücuttan çıkarıldığında, bağırsak ve/veya ventral sinir kordonu kafaya bağlı kalır ve diseksiyona devam etmeden önce çıkarılmalıdır.
  6. Bir çift kuş tarak hortumunu kavrarken, ikinci çift sağ uçucu gözün medial kenarını kavramalıdır. Yavaşça, toparlamaları birbirinden ayırın. Bu adım az miktarda sabit yanal kuvvetle gerçekleştirilmelidir. Kanatçıklar birbirlerinden yavaşça uzaklaştıkça, hortum kafadan çekilmeli ve kafa kütikülde merkezi bir delik oluşturmalıdır. Sağ gözün medial kısmını ikinci çiftten serbest bırakmadan ilk çift asa ile hortumları atın.
    NOT: Yetişkin D. melanogaster beyni sinek başının kaudal(yani,arka/ arka) bölgesindedir. Bu nedenle, başın o bölgesini kavramaktan kaçınılmalıdır. İdeal olarak, başın medial retinaya yakın sadece rostral(yaniön) kısmı doğrudan asalar tarafından kavranmalıdır. Beyin ve ilişkili trakea artık maniküldeki merkezi delikten görülmelidir. Şu anda, delikten çıkıntılı herhangi bir beyaz telli trakea ipliği çıkarılabilir ve atılabilir.
  7. İkinci kümes taşı çiftiyle, sol retinanın medial kenarını kavrayın (kafa kütiküldeki merkezi deliğin kenarında). Retinaları ve ilişkili kütikülleri çıkarmak için, 180 ° açıyla tokmakları yavaşça bir birinden çekin. Retina alttaki optik lobdan ayrıştıkça, gerginlikte hafif bir azalma hissetmelisiniz. Optik lobun yırtılmasını önlemek için yavaşça ilerleyin.
    NOT: Bu adım sırasında ataların çok hızlı ayrılması optik lobun yırtılmasına veya mantar vücut yapılarının bozulmasına neden olabilir. Bazen, manikül çıkarılır, ancak retina parçaları optik loba bağlı kalır. Mantar gövdelerini görüntülüyorsanız, tüm retinayı çıkarmak tamamen gerekli değildir. Bununla birlikte, diğer beyin bölgelerinin analizi (optik beyin loblarının retinal nöron innervasyonu gibi) retinanın açıklandığı gibi tamamen çıkarılmasını gerektirebilir.
    NOT: Retina beynin alttaki optik lobundan yavaşça ayrıldığından, optik lob beyaz, telli trakea ile kaplı opak beyaz bir yapı olarak gözlemlenebilir olmalıdır. Bir retina çıkarıldıktan sonra atılabilir. Retina nöronlarının yol buluculuk analiz edilirken, optik lobun zarar görmesini önlemek için bu adım sırasında özellikle dikkatli olunmalıdır. Fotoreceptör nöronlarının diseksiyonu ve canlı görüntülenmesi üzerine odaklanan ek bir protokol de mevcuttur.
  8. Şimdi, görünür trakeanın mümkün olduğunca çoğunu dikkatlice çıkarın. Trakea zaten hava içerebilir veya daha sonra hava ile doldurulabilir, bu da beyinlerin yüzmesine ve potansiyel olarak daha sonraki immünostaining adımları sırasında kaybolmasına neden olabilir. Trakeayı çıkarmak için, çok keskin bir çift #5 toparlağı kullanarak beyinden çıkarın.
  9. Sol sinek retinasının medial bölgesini kavramak için her iki kümes tokası çiftini kullanarak kalan retinayı ve çevresindeki kütikülleri çıkarın. Retina ve manikül parçalarını çıkarmak için retinayı dikkatlice ikiye bölün. Bazı durumlarda, kalan maniklenin beyni ezmeden çıkarılması özellikle zor olduğunu kanıtlamaktadır. Bu durumlarda, ventral sinir kordonunun kalan iplikçiklerinin bunun yerine bir çift tokmak tarafından kavranabileceğini, diğer bir çift manikülün sonuncusunun dikkatlice çıkarılması için kullanıldığını bulduk.
  10. Bir p200 pipet kullanarak, parçalanmış beyinleri PTN içeren 9 veya 3 kuyulu tabaktan bir kuyuya taşıyın. Aynı genotip beyinleri aynı kuyuda bir araya gelmeli ve buzda tutulmalıdır. Beyin dokusu diseksiyondan sonraki bir saat içinde düzeltilmelidir. Daha fazla sayıda beyin gerekiyorsa beyinler küçük gruplar halinde sabitlenebilir ve birikebilir. Çoğu durumda, deneyimli bir araştırmacı genellikle bir beyni parçalara alabilir ve yaklaşık 3 - 5 dakika içinde cam toplama kabına aktarabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microdissection forceps/tweezers Ted Pella 505-NM
Sylgard dishes Living Systems Instrumentation DD-50-S-BLK Available from amazon.com
Na Phosphate Buffer monobasic Sigma S3139
Triton X 100 Sigma X100-100ml
stereomicroscope Leica S6D with KL300 LED light source
9-well dish (spot plate) VWR 89090-482
35mm dish Genesee Scientific 32-103
Sylgard Fisher 50-366-794
Kimwipe Fisher 06-666
PTN Buffer 0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, Typically make up 0.5 L of 0.1M NaPhosphate buffer and aliquote 50ml at a time as needed

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Tags

Boş Değer Sorun
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter