Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Encyclopedia of Experiments

דרוזופילה (לא כולל) ניתוח מוח למבוגרים: שיטה בנוירוביולוגיה מעופפת

Overview

סרטון זה מתאר כיצד לנתח ולבודד את המוח הבוגר של דרוזופילה – הליך הנחוץ להדמיית האיבר, אשר מוסתר אחרת על ידי הקוטיקל, העין ורקמת קנה הנשימה. פרוטוקול הדוגמה מראה הדגמה מפורטת המניבה תכשירים באיכות גבוהה שיכולים לשמש לשיטות חיסון והדמיה בנוירוביולוגיה של דרוזופילה.

Protocol

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך קלי ואח ',,ניתוח ו כתמים אימונופלואורסצנטיים של גוף פטריות נוירונים פוטורצפטורים במוחות מלנוגסטר דרוזופילה למבוגרים, J. Vis. Exp. (2017).

1. הכנת תחנת ניתוח

  1. מקם את הסטריאומיקרוסקופ ואת מקור האור עם עור ברווז סיבים אופטיים מחוברים על ספסל גדול. כדי לקדם תנועות ידיים יציבות ולהפחית את היד "ללחוץ" תוך ניתוח, זה חיוני כי מרחב מנוחה יד וזרוע נאותה זמין סביב המיקרוסקופ. ודא כי יש כ 8 - 10 סנטימטרים משני צדי המיקרוסקופ ו 4 - 6 סנטימטרים בין הבסיס של מיקרוסקופ וקצה הספסל.
  2. מלאו 2 או 3 בארות של צלחת זכוכית 9 באר או 3 באר עם 1.0 מ"ל של חיץ PTN (0.1 M נתרן פוספט חוצץ pH 7.2, 0.1% פעילי שטח nonionic, ראה טבלה של חומרים עבור רכיבי חיץ מלא) ומניחים ליד תחנת הניתוח על קרח. מוחות שנותחו לאחרונה יועברו למנה זו ויאוחסנו עד לשלב הקיבעון.
    שים לב: אם נדרשת הדמיה חיה, מאגר הניתוח צריך להיות מאגר מלוחים עם מאגר פוספט (PBS) או HL3. אם נדרש לוקליזציה של חלבון תאי, PBS יכול לשמש גם כחוצץ חלופי לניתוח וקיבעון. לאחר הקיבעון, יש לבצע חדירות של קרום התא באמצעות שטיפות PTN המכילות 0.1% או 0.3% חומר ניקוי לא איוני.
    1. אם PBS משמש לניתוחים וקיבעון, יש לשטוף טיפים לפיפטות לפחות פעם אחת עם חיץ המכיל חומר ניקוי (כגון PTN) כדי למנוע ממוחות להידבק לטיפים של פיפטה מפלסטיק במהלך ההעברה לצינורות מיקרוצנטריפוגה.
  3. בעזרת ריקה של 35 ממ או צלחת פטרי מפלסטיק, בונים צלחת ניתוח המכילה אלסטומר סיליקון. בקצרה, מערבבים את רכיבי האלסטומר לפי הוראות היצרן, יוצקים לתוך 35 מ"מ כלים, ולתת לו ל polymerize לילה על משטח שטוח. אלסטומר המכיל מנות ניתוח יש להשתמש כדי להגן על הטיפים העדינים של מלקחיים לנתח, אשר יכול בקלות להיפגע אם מגע נעשה בין המלקחיים משטח קשה יותר, כגון צלחת זכוכית. אנו גם רוכשים באופן קבוע מנות מצופות סיליקון הזמינות מסחרית מקמעונאים מקוונים. כדי להגביר את הניגודיות במהלך ניתוחים, מנות ניתוח אלסטומר סיליקון המכיל פחם מושבת (ובכך שחור צבעוני) שימושיים במיוחד.

2. הליך ניתוח מוח למבוגרים

  1. הרדמה 3 - 5 יום מבוגר D. melanogaster עם CO2 או באמצעות קרח. אם משתמשים בקרח, מניחים את הבקבוקון המכיל זבובים הפוכים (תקע סוף למטה) לתוך דלי קרח במשך ~ 5 דקות. הנחת הבקבוקון בקרח במהופך מונעת מזבובים להיתקע במזון. לאחר זבובים כבר הרדמה, מניחים את הזבובים על כרית מתכת קרה או צלחת פטרי יושב בקרח או על כרית זבוב פולט CO2. אם מנתחים מוחות כדי לנתח ניוון עצבי, ניתן להשתמש גם בזבובים ישנים יותר.
  2. מניחים כמות קטנה (150 - 200 μL) של PTN במרכז צלחת הניתוח באמצעות פיפטה העברה או פיפטה p200 כדי ליצור "בועה" של PTN. מניחים את צלחת הניתוח מתחת לסטריאומיקרוסקופ ומתאימים את התאורה והמיקוד כך שהבועה של PTN ממלאת את שדה הראייה ומאורה באופן אחיד.
  3. לתפעל זבובים כך שהם "בטן למעלה"(כלומר,בצד הגחוני למעלה) תוך שכיבה על המתכת או CO2 כרית.
  4. באמצעות זוג אחד של מלקחיים #5, לתפוס את הבטן של זבוב להיות מנותח, ו, שמירה על אחיזה של זבוב, לחלוטין להטביע אותו PTN על צלחת הניתוח.
    שים לב: עבור שאר הפרוטוקול, יש לבצע את כל השלבים כאשר הראש שקוע ב- PTN.
  5. באמצעות זוג שני של מלקחיים #5, לתפוס את הבסיס של proboscis זבוב ולמשוך את שני זוגות של מלקחיים לגזרים כדי לנתק את ראש לעוף מהגוף. השלך את הבטן ואת בית החזה. במהלך שלב זה, זה קריטי כי הראש אינו משוחרר מותר לצוף על פני השטח של PTN. ברגע שהראש צף, זה יכול להיות מאוד קשה לתפוס שוב מבלי למחוץ את המוח.
    שים לב: בשיטה זו, קשרים בין המוח לבין חוט העצבים הגחוני נקטרים. אם נדרשים חיבורים שלמים בין אזורים אלה של מערכת העצבים המרכזית, יש לעקוב אחר פרוטוקול ניתוח חלופי. אם הפרובוסיס מתנתק מראש הזבוב לפני שהראש מוסר, יהיה חור שבו היה הפרובוסיס. במקרה זה, לתפוס את הראש לעוף בקצה החור ליד עין אחת. לאחר מכן להסיר את הראש באמצעות כמות מתונה של כוח תוך משיכת שני זוגות של מלקחיים זה מזה. מדי פעם, כאשר הראש מוסר מהגוף, המעיים ו / או חוט העצבים הגחוני נשאר מחובר לראש ויש להסירו לפני שתמשיך את הניתוח.
  6. בעוד זוג מלקחיים אחד תופס את הפרובוסיס, הזוג השני צריך לתפוס את הקצה המדיאלי של עין הזבוב הימנית. לאט לאט, למשוך את המלקחיים זה מזה. שלב זה צריך להתבצע עם כמות קטנה של כוח לרוחב יציב. כמו מלקחיים לאט להתרחק אחד מהשני, proboscis צריך להתרחק מהראש וליצור חור מרכזי בקוטיקל הראש. השלך את proboscis עם זוג מלקחיים הראשון מבלי לשחרר את החלק המדיאלי של העין הימנית מן הזוג השני.
    שים לב: המוח הבוגר D. melanogaster נמצא באזור caudal(כלומר,אחורי / אחורי) של ראש הזבוב. לכן, לתפוס את האזור הזה של הראש יש להימנע. באופן אידיאלי, רק את החלק rostral(כלומר,חזית) של הראש ליד הרשתית המדיאלית צריך להיות נתפס ישירות על ידי מלקחיים. המוח וקנה הנשימה הקשורים עכשיו צריך להיות גלוי דרך החור המרכזי בקוטיקל. בשלב זה, כל חוטים חוטיים לבנים של קנה הנשימה בולט מהחור ניתן להסיר ולהשליך.
  7. עם זוג המלקחיים השני, לתפוס את הקצה המדיאלי של הרשתית השמאלית (בקצה החור המרכזי של קוטיקל הראש). כדי להסיר את הרשתיות ואת הקוטיקל המשויך, משוך לאט את המלקחיים אחד מהשני בזווית של 180°. כמו הרשתית מנותקת מן האונה האופטית הבסיסית, אתה צריך להרגיש ירידה קלה במתח. המשך לאט כדי למנוע קריעת האונה האופטית.
    שים לב: הפרדת המלקחיים מהר מדי במהלך שלב זה עלולה לגרום לקריעת האונה האופטית או להפרעה של מבני גוף פטריות. מדי פעם, הקוטיקולה תוסר אבל חתיכות של הרשתית יישאר מחובר לאונה האופטית. אם הדמיה של גופי פטריות, אין צורך לחלוטין להסיר את הרשתית כולה. עם זאת, ניתוח של אזורי מוח אחרים (כגון innervation נוירון רשתית של אונות המוח האופטי) עשוי לדרוש הרשתית להיות מוסר לחלוטין כמתואר על ידי.
    שים לב: כמו הרשתית מופרדת לאט מן האונה האופטית הבסיסית של המוח, האונה האופטית צריכה להיות נצפית כמו מבנה לבן אטום מכוסה לבן, קנה הנשימה חוטי. לאחר רשתית אחת הוסרה, זה יכול להיות מושלך. בעת ניתוח pathfinding של נוירונים ברשתית, טיפול מסוים יש לנקוט במהלך צעד זה כדי למנוע נזק לאונה האופטית. פרוטוקול נוסף המתמקד ניתוח הדמיה חיה של נוירונים פוטורצפטור זמין גם.
  8. עכשיו, בזהירות להסיר כמה שיותר קנה הנשימה גלוי ככל האפשר. קנה הנשימה עשוי כבר להכיל או מאוחר יותר למלא עם אוויר, גורם למוח לצוף, פוטנציאל, ללכת לאיבוד במהלך צעדים immunostaining מאוחר יותר. כדי להסיר קנה הנשימה, להרים אותו מהמוח באמצעות זוג חד מאוד של מלקחיים #5.
  9. הסר את הרשתית הנותרת ואת הקוטיקל שמסביב באמצעות שני זוגות של מלקחיים כדי לתפוס את האזור המדיאלי של הרשתית זבוב שמאל. בזהירות לקרוע את הרשתית לשניים כדי להסיר חתיכות של הרשתית ואת הקוטיקל. במקרים מסוימים, הסרת הקוטיקל הנותר מבלי למחוץ את המוח מוכיחה מאתגרת במיוחד. במקרים אלה, מצאנו כי הגדילים הנותרים של חוט העצבים הגחוני יכולים במקום זאת להיתפס על ידי זוג אחד של מלקחיים בעוד זוג המלקחיים האחר משמש בזהירות כדי להסיר את האחרון של הקוטיקל.
  10. באמצעות פיפטה p200, להעביר מוח מנותח לבאר אחת של 9 או 3-באר צלחת המכילה PTN. מוחות מאותו גנוטיפ צריכים להיות מאוגדים יחד לאותה באר ושמורים על קרח. רקמת המוח צריכה להיות קבועה בתוך שעה אחת של ניתוח. המוח יכול להיות קבוע בקבוצות קטנות ומאגר אם מספר גדול יותר של מוחות נדרש. ברוב הנסיבות, חוקר מנוסה יכול בדרך כלל לנתח מוח ולהעביר אותו לצלחת איסוף הזכוכית בתוך כ 3 - 5 דקות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microdissection forceps/tweezers Ted Pella 505-NM
Sylgard dishes Living Systems Instrumentation DD-50-S-BLK Available from amazon.com
Na Phosphate Buffer monobasic Sigma S3139
Triton X 100 Sigma X100-100ml
stereomicroscope Leica S6D with KL300 LED light source
9-well dish (spot plate) VWR 89090-482
35mm dish Genesee Scientific 32-103
Sylgard Fisher 50-366-794
Kimwipe Fisher 06-666
PTN Buffer 0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, Typically make up 0.5 L of 0.1M NaPhosphate buffer and aliquote 50ml at a time as needed

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Tags

ערך ריק הנפקה
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter