Drosophila Voksen hjerne disseksjon: En metode i fly nevrobiologi

Overview

Denne videoen beskriver hvordan du dissekerer og isolerer den voksne Drosophila-hjernen - en prosedyre som er nødvendig for å visualisere orgelet, som ellers er skjult av kutiklet, øyet og trakealvevet. Eksempelprotokollen viser en detaljert demonstrasjon som gir preparater av høy kvalitet som kan brukes til immundempende og avbildningsmetoder i Drosophila nevrobiologi.

Protocol

Denne protokollen er et utdrag fra Kelly et al., Dissection og Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains, J. Vis. Exp. (2017).

1. Klargjøring av disseksjonsstasjon

1. Plasser stereomikroskopet og lyskilden med vedlagte fiberoptiske goosenecks på en stor benkeplate. For å fremme stødige håndbevegelser og redusere hånd "riste" mens dissekering, er det viktig at tilstrekkelig hånd- og armstøtteplass er tilgjengelig rundt mikroskopet. Forsikre deg om at det er omtrent 8 - 10 tommer på hver side av mikroskopet og 4 - 6 tommer mellom bunnen av mikroskopet og kanten av benken.
2. Fyll 2 eller 3 brønner av en glass 9-brønns eller 3-brønns tallerken med 1,0 ml PTN buffer (0,1 M natriumfosfatbuffer pH 7,2, 0,1% ikke-ionisk overflateaktivt middel, se Materialtabell for komplette bufferkomponenter) og plasser ved siden av dissekeringsstasjonen på is. Nylig dissekerte hjerner vil bli overført til denne parabolen og lagret til fikseringstrinnet.
   MERK: Hvis levende avbildning er nødvendig, bør disseksjonsbufferen være 1x fosfatbufret saltvannsbuffer (PBS) eller HL3-buffer. Hvis lokalisering av intracellulært protein er nødvendig, kan PBS også brukes som en alternativ buffer for avhandling og fiksering. Etter fiksering bør permeabilisering av cellemembraner deretter utføres ved hjelp av PTN-vasker som inneholder 0,1% eller 0,3% ikke-ionisk vaskemiddel.
   1. Hvis PBS brukes til disseksjoner og fiksering, bør pipettespisser skylles minst én gang med en vaskemiddelholdig buffer (for eksempel PTN) for å forhindre at hjernen fester seg til pipettespissene i plast under overføring til mikrocentrifugerør.
3. Bruk en tom 35 mm glass- eller plastfat til å konstruere en disseksjonsfat som inneholder en silikonelastomer. Bland kort elastomerkomponentene i henhold til produsentens anvisninger, hell i 35 mm retter, og la det polymerisere over natten på en flat overflate. Elastomer som inneholder disseksjonsretter, bør brukes til å beskytte de fine spissene for dissekering av tang, som lett kan skades hvis det gjøres kontakt mellom tangene og en hardere overflate, for eksempel en glassfat. Vi kjøper også regelmessig kommersielt tilgjengelige silikonbelagte retter fra nettbutikker. For å øke kontrasten under disseksjoner, er silikon elastomer disseksjonsretter som inneholder inaktivert trekull (og dermed farget svart) spesielt nyttige.

2. Voksen hjerne disseksjon prosedyre

1. Bedøv 3 - 5 dager gammel voksen D. melanogaster med CO₂ eller ved bruk av is. Hvis du bruker is, plasserer du hetteglasset som inneholder fluer opp ned (pluggenden ned) i en isbøtte i ca. 5 min. Å plassere hetteglasset i is opp ned hindrer fluer i å bli sittende fast i maten. Når fluer har blitt bedøvet, plasser fluene på en kald metallpute eller petriskål som sitter i is eller på en CO_2-avgivende flypute. Hvis dissekerer hjerner for å analysere nevrodegenerasjon, kan eldre fluer også brukes.
2. Plasser en liten mengde (150 - 200 μL) PTN i midten av disseksjonsfatet ved hjelp av en overføringspipette eller en p200 pipette for å skape en "boble" av PTN. Plasser disseksjonsfatet under stereomikroskopet og juster belysningen og fokuset slik at boblen til PTN fyller synsfeltet og lyser jevnt.
3. Manipulere fluer slik at de er "mage opp" (dvs., ventral side opp) mens du ligger på metallet eller CO₂ pad.
4. Bruk ett par #5 tang, ta tak i underlivet på en flue som skal dissekeres, og hold fast på fluen, senk den helt ned i PTN på disseksjonsfatet.
   MERK: For resten av protokollen bør alle trinn utføres mens hodet er nedsenket i PTN.
5. Ved hjelp av et annet par #5 tang, ta tak i basen på flyproboscis og trekk de to par tangene fra hverandre for å løsne fluehodet fra kroppen. Kast magen og thoraxen. I løpet av dette trinnet er det kritisk at hodet ikke frigjøres og får lov til å flyte på overflaten av PTN. Når hodet flyter, kan det være svært vanskelig å forstå igjen uten å knuse hjernen.
   MERK: Ved hjelp av denne metoden blir forbindelsene mellom hjernen og ventral nerveledning kuttet. Hvis det kreves intakte forbindelser mellom disse områdene i tilkoblet nettverk, bør en alternativ disseksjonsprotokoll følges. Hvis proboscis løsner fra fluehodet før hodet fjernes, vil det være et hull der proboscis var. I dette tilfellet, ta tak i flyhodet på kanten av hullet nær ett øye. Fjern deretter hodet med en moderat mengde kraft mens du trekker de to parene tang bortsett fra hverandre. Av og til, når hodet er fjernet fra kroppen, forblir tarmen og / eller ventral nerveledningen festet til hodet og bør fjernes før du fortsetter disseksjonen.
6. Mens ett par tang griper proboscis, bør det andre paret gripe medialkanten av høyre flyøye. Trekk tangene sakte fra hverandre. Dette trinnet skal utføres med en liten mengde jevn lateral kraft. Når tangene sakte beveger seg fra hverandre, bør proboscis trekke seg bort fra hodet og skape et sentralt hull i hodeskjelv. Kast proboscis med det første par tang uten å frigjøre medialdelen av høyre øye fra det andre paret.
   MERK: Den voksne D. melanogaster hjernen er i kaudal (dvs., bakre / bakre) regionen av flyhodet. Dermed bør det unngås å gripe den regionen av hodet. Ideelt sett bør bare rostral(dvs.foran) delen av hodet nær medial netthinnen forstås direkte av tangene. Hjernen og tilhørende luftrør skal nå være synlig gjennom det sentrale hullet i kutiklet. På dette tidspunktet kan eventuelle hvite strenge tråder av luftrør som stikker ut fra hullet fjernes og kastes.
7. Med det andre par tang, ta tak i medialkanten av venstre netthinne (på kanten av det sentrale hullet i hodesperlen). For å fjerne netthinnene og tilhørende kutikal, trekk tangene sakte bort fra hverandre i en 180° vinkel. Når netthinnen dissosierer fra den underliggende optiske loben, bør du føle en liten nedgang i spenningen. Fortsett sakte for å forhindre at den optiske loben rives.
   MERK: Separering av tang for raskt i løpet av dette trinnet kan føre til riving av optisk lobe eller forstyrrelse av sopp kroppsstrukturer. Av og til vil kutiklet bli fjernet, men deler av netthinnen forblir festet til den optiske loben. Hvis du ser på sopplegemene, er det ikke helt nødvendig å fjerne hele netthinnen. Imidlertid kan analyse av andre hjerneregioner (som retinal neuron innervasjon av de optiske hjernelobene) kreve at netthinnen fjernes helt som beskrevet av.
   MERK: Siden netthinnen sakte skilles fra den underliggende optiske loben i hjernen, bør den optiske loben være observerbar som en ugjennomsiktig hvit struktur dekket med hvit, streng luftrør. Når en netthinne er fjernet, kan den kastes. Når du analyserer pathfinding av retinal nevroner, bør det tas særlig hensyn under dette trinnet for å forhindre skade på den optiske loben. En ekstra protokoll fokusert på disseksjon og levende bildebehandling av fotoreseptorne nevroner er også tilgjengelig.
8. Fjern nå forsiktig så mye av den synlige luftrøret som mulig. Luftrøret kan allerede inneholde eller senere fylles med luft, noe som får hjernen til å flyte og potensielt gå tapt under senere immunoppnåelsestrinn. For å fjerne luftrøret, plukk det av hjernen ved hjelp av et veldig skarpt par #5 tang.
9. Fjern gjenværende netthinne og omkringliggende kutikal ved å bruke begge par tang for å gripe medialområdet til venstre fly netthinne. Riv netthinnen forsiktig i halvparten for å fjerne biter av netthinnen og neglebåndet. I noen tilfeller viser det seg spesielt utfordrende å fjerne den gjenværende kutiklen uten å knuse hjernen. I disse tilfellene har vi funnet ut at de resterende trådene i ventral nerveledningen i stedet kan gripes av ett par tang mens det andre par tang brukes til å forsiktig fjerne den siste av kutiklet.
10. Bruk en p200 pipette, flytt dissekerte hjerner til en brønn av 9- eller 3-brønnsretten som inneholder PTN. Hjerner av samme genotype bør samles i samme brønn og holdes på is. Hjernevev bør fikses innen en time etter disseksjon. Hjerner kan festes i små partier og samles hvis et større antall hjerner er nødvendig. Under de fleste omstendigheter kan en erfaren forsker vanligvis dissekere en hjerne og overføre den til glassoppsamlingsfatet på ca. 3 - 5 min.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microdissection forceps/tweezers	Ted Pella	505-NM
Sylgard dishes	Living Systems Instrumentation	DD-50-S-BLK	Available from amazon.com
Na Phosphate Buffer monobasic	Sigma	S3139
Triton X 100	Sigma	X100-100ml
stereomicroscope	Leica S6D with KL300 LED light source
9-well dish (spot plate)	VWR	89090-482
35mm dish	Genesee Scientific	32-103
Sylgard	Fisher	50-366-794
Kimwipe	Fisher	06-666
PTN Buffer			0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, Typically make up 0.5 L of 0.1M NaPhosphate buffer and aliquote 50ml at a time as needed