Drosophila (olika betydelser) Vuxen hjärn dissekering: En metod i flyga neurobiologi

Overview

Denna video beskriver hur man dissekerar och isolerar den vuxna Drosophila hjärnan -ett förfarande som är nödvändigt för att visualisera organet, som annars skyms av nagelband, öga och trakeal vävnad. Exempelprotokollet visar en detaljerad demonstration som ger högkvalitativa preparat som kan användas för immunostaining och avbildningsmetoder i Drosophila neurobiologi.

Protocol

Detta protokoll är ett utdrag från Kelly et al., Dissekering och immunofluorescerande färgning av svamp kropp och fotoreceptor nervceller i vuxna Drosophila melanogaster hjärnor, J. Vis. Exp. (2017).

1. Förberedelse av dissekeringsstation

1. Placera stereomikroskopet och ljuskällan med fastsatta fiberoptiska gåshud på en stor bänkskiva. För att främja stadiga handrörelser och minska hand "skaka" under dissekering är det viktigt att det finns tillräckligt med hand- och armstödsutrymme runt mikroskopet. Se till att det finns cirka 8 - 10 tum på vardera sidan av mikroskopet och 4 - 6 tum mellan basen av mikroskopet och kanten av bänken.
2. Fyll 2 eller 3 brunnar av en glas 9-brunns- eller 3-brunns skål med 1,0 ml PTN-buffert (0,1 M natriumfosfatbuffert pH 7,2, 0,1% nonionic tensid, se Materialförteckning för kompletta buffertkomponenter) och placera bredvid dissekeringsstationen på is. Nyligen dissekerade hjärnor kommer att överföras till denna maträtt och lagras tills fixeringssteget.
   OBS: Om levande avbildning krävs bör dissektionsbufferten vara 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) eller HL3-buffert. Om intracellulär proteinlokalisering krävs kan PBS också användas som en alternativ buffert för dissekering och fixering. Efter fixering, permeabilisering av cellmembran bör sedan utföras med PTN tvättar som innehåller 0,1% eller 0,3% nonionic tvättmedel.
   1. Om PBS används för dissekering och fixering ska pipettspetsarna sköljas minst en gång med en tvättmedelshaltig buffert (t.ex. PTN) för att förhindra att hjärnan fastnar på plastpipettspetsarna under överföringen till mikrocentrifugrör.
3. Använd en tom petriskål i 35 mm glas eller plast och konstruera en dissekeringsform som innehåller en silikon elastomer. Blanda kort elastomerkomponenterna enligt tillverkarens anvisningar, häll i 35 mm rätter och låt den polymerisera över natten på en plan yta. Elastomer som innehåller dissektionsfat bör användas för att skydda de fina spetsarna av dissekerande tång, som lätt kan skadas om kontakt görs mellan tången och en hårdare yta, till exempel en glasform. Vi köper också regelbundet kommersiellt tillgängliga silikonbelagda rätter från online-återförsäljare. För att öka kontrasten under dissekeringar är silikon elastomer dissekeringsfat som innehåller inaktiverat kol (och därmed färgat svart) särskilt användbara.

2. Vuxen hjärna dissekering förfarande

1. Söv 3 - 5 dagar gammal vuxen D. melanogaster med CO_{2 eller} genom att använda is. Om du använder is, placera injektionsflaskan som innehåller flugor upp och ner (plugga änden ner) i en ishink i ~5 min. Att placera injektionsflaskan i is upp och ner förhindrar att flugor fastnar i maten. När flugor har sövts, placera flugorna på en kall metallplatta eller petriskål som sitter i is eller på en CO_2-avgivande flugkudde. Om dissekering av hjärnor för att analysera neurodegeneration, äldre flugor kan också användas.
2. Placera en liten mängd (150 - 200 μL) PTN i mitten av dissekeringsfatet med hjälp av en överföringspipett eller en p200-pipett för att skapa en "bubbla" av PTN. Placera dissekeringsskålen under stereomikroskopet och justera belysningen och fokuset så att PTN:s bubbla fyller synfältet och är jämnt upplyst.
3. Manipulera flugor så att de är "mageupp" (dvs.ventral sida upp) medan de ligger på metallen eller CO_{2 pad.}
4. Använd ett par #5 tång, ta tag i buken på en fluga som ska dissekeras och håll i flugan, helt nedsänkt den i PTN på dissekeringsskålen.
   OBS: Under resten av protokollet bör alla steg utföras medan huvudet är nedsänkt i PTN.
5. Använd ett andra par #5 tång, ta tag i basen av flugproboscisen och dra isär de två krafterna för att lossa flughuvudet från kroppen. Kassera buken och bröstkorgen. Under detta steg är det viktigt att huvudet inte frigörs och får flyta på PTN: s yta. När huvudet flyter kan det vara mycket svårt att greppa igen utan att krossa hjärnan.
   OBS: Med denna metod avskurs anslutningar mellan hjärnan och ventral nervkabel. Om intakta anslutningar mellan dessa regioner i CNS krävs bör ett alternativt dissekeringsprotokoll följas. Om proboscisen lossnar från flughuvudet innan huvudet tas bort, kommer det att finnas ett hål där proboscisen var. I det här fallet, fatta tag i flughuvudet vid hålets kant nära ett öga. Ta sedan bort huvudet med en måttlig mängd kraft samtidigt som du drar isär de två två tångparen från varandra. Ibland, när huvudet avlägsnas från kroppen, förblir tarmen och/eller ventrala nervsladden fastsatt på huvudet och bör avlägsnas innan dissekeringen fortsätter.
6. Medan ett par tångar griper tag i proboscisen, bör det andra paret greppa den mediala kanten av det högra flugögat. Dra sakta isär tången från varandra. Detta steg bör utföras med en liten mängd stadig sidokraft. När tången långsamt rör sig isär från varandra, bör proboscisen dra bort från huvudet och skapa ett centralt hål i huvudskuret. Kassera proboscisen med det första paret tång utan att släppa den mediala delen av höger öga från det andra paret.
   OBS: Den vuxna D. melanogaster hjärnan är i kaudal(dvs.bakre / bakre) regionen av flughuvudet. Således bör man undvika att greppa den regionen i huvudet. Helst bör endast rostral(dvs.främre) delen av huvudet nära den mediala näthinnan gripas direkt av tången. Hjärnan och tillhörande luftstrupe bör nu vara synliga genom det centrala hålet i nagelbandet. Vid denna tidpunkt kan alla vita strängtrådar av luftstrupe som sticker ut från hålet tas bort och kasseras.
7. Med det andra paret tångar, fatta tag i den mediala kanten av vänster näthinna (vid kanten av det centrala hålet i huvudskuret). För att ta bort näthinnan och tillhörande nagelband, dra långsamt tången bort från varandra i 180° vinkel. Eftersom näthinnan tar avstånd från den underliggande optiska loben bör du känna en liten minskning av spänningen. Fortsätt långsamt för att förhindra att optikloben rivs.
   OBS: Att separera tången för snabbt under detta steg kan leda till att optikloben rivs eller svampkroppsstrukturerna störs. Ibland kommer nagelbandet att avlägsnas men bitar av näthinnan kommer att förbli fästa vid optikloben. Vid avbildning av svampkropparna är det inte helt nödvändigt att ta bort hela näthinnan. Analys av andra hjärnregioner (såsom retinal neuron innervation av optik hjärnan lober) kan dock kräva näthinnan att tas bort helt som beskrivs av.
   OBS: Eftersom näthinnan långsamt separeras från hjärnans underliggande optiska lob, bör optikloben kunna observeras som en ogenomskinlig vit struktur täckt med vit, sträng luftstrupe. När en näthinna har tagits bort kan den kasseras. Vid analys av pathfinding av näthinneneuroner bör särskild försiktighet vidtas under detta steg för att förhindra skador på optikloben. Ett extra protokoll med fokus på dissekering och live-avbildning av fotoreceptorneuronerna finns också tillgängligt.
8. Ta nu försiktigt bort så mycket av den synliga luftstrupen som möjligt. Luftstrupen kan redan innehålla eller senare fyllas med luft, vilket gör att hjärnor flyter och eventuellt går förlorade under senare immunostainingsteg. För att ta bort luftstrupe, plocka den från hjärnan med ett mycket skarpt par #5 tång.
9. Ta bort den återstående näthinnan och den omgivande nagelbanden genom att använda båda tvångsparen för att greppa den mediala regionen i den vänstra flughinnan. Riv försiktigt näthinnan i hälften för att ta bort bitar av näthinnan och nagelbandet. I vissa fall visar sig det vara särskilt utmanande att ta bort den återstående nagelbanden utan att krossa hjärnan. I dessa fall har vi funnit att de återstående strängarna i ventrala nervkabeln istället kan gripas av ett par tångar medan det andra paret tång används för att försiktigt ta bort den sista av nagelbandet.
10. Använd en p200 pipett, flytta dissekerade hjärnor till en brunn av 9- eller 3-brunnsfatet som innehåller PTN. Hjärnor av samma genotyp bör slås samman i samma brunn och hållas på is. Hjärnvävnad bör fixas inom en timme efter dissekering. Hjärnor kan fixas i små partier och poolas om ett större antal hjärnor krävs. Under de flesta omständigheter kan en erfaren forskare vanligtvis dissekera en hjärna och överföra den till glassamlingsrätten på cirka 3- 5 minuter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microdissection forceps/tweezers	Ted Pella	505-NM
Sylgard dishes	Living Systems Instrumentation	DD-50-S-BLK	Available from amazon.com
Na Phosphate Buffer monobasic	Sigma	S3139
Triton X 100	Sigma	X100-100ml
stereomicroscope	Leica S6D with KL300 LED light source
9-well dish (spot plate)	VWR	89090-482
35mm dish	Genesee Scientific	32-103
Sylgard	Fisher	50-366-794
Kimwipe	Fisher	06-666
PTN Buffer			0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, Typically make up 0.5 L of 0.1M NaPhosphate buffer and aliquote 50ml at a time as needed