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Encyclopedia of Experiments

Drosofilia Dissezione cerebrale adulta: un metodo nella neurobiologia della mosca

Overview

Questo video descrive come sezionare e isolare il cervello adulto di Drosophila- una procedura necessaria per visualizzare l'organo, che è altrimenti oscurato dalla cuticola, dall'occhio e dal tessuto tracheale. Il protocollo di esempio mostra una dimostrazione dettagliata che produce preparati di alta qualità che possono essere utilizzati per l'immunostaining e i metodi di imaging nella neurobiologia drosophila.

Protocol

Questo protocollo è un estratto da Kelly et al., Dissezione e colorazione immunofluorescente del corpo dei funghi e dei neuroni fotorecettori nei cervelli adulti drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017).

1. Preparazione della stazione di dissezione

  1. Posizionare lo stereomicroscopio e la sorgente luminosa con i colli d'oca in fibra ottica collegati su un grande banco. Per promuovere movimenti costanti delle mani e ridurre la "stretta" della mano durante la sezionazione, è essenziale che intorno al microscopio sia disponibile un adeguato spazio di riposo per mani e braccia. Assicurarsi che ci siano circa 8 - 10 pollici su entrambi i lati del microscopio e 4 - 6 pollici tra la base del microscopio e il bordo del banco.
  2. Riempire 2 o 3 pozzali di un piatto di vetro da 9 o 3 poggiale con 1,0 mL di tampone PTN (0,1 M Sodium Phosphate Buffer pH 7.2, 0.1% tensioattiva non ionico, vedi Tabella dei materiali per componenti tampone completi) e posizionare accanto alla stazione di dissezione sul ghiaccio. I cervelli appena sezionati verranno trasferiti in questo piatto e conservati fino alla fase di fissazione.
    NOTA: Se è richiesta l'imaging vivo, il buffer di dissezione deve essere 1x tampone pbs (Phosphate Buffered Saline) o HL3. Se è richiesta la localizzazione delle proteine intracellulari, il PBS può anche essere usato come buffer alternativo per la dissezione e la fissazione. Dopo la fissazione, la permeabilità delle membrane cellulari deve quindi essere eseguita utilizzando lavaggi PTN contenenti detergente non ionico 0,1% o 0,3%.
    1. Se il PBS viene utilizzato per dissezioni e fissazioni, le punte delle pipette devono essere risciacquate almeno una volta con un tampone contenente detergenti (come PTN) per evitare che il cervello si attacchi alle punte delle pipette di plastica durante il trasferimento in tubi di microcentrifugo.
  3. Utilizzando una piastra di petri vuota in vetro o plastica da 35 mm, costruisci una piastra di dissezione contenente un elastomero siliconico. In breve, mescolare i componenti dell'elastomero secondo le indicazioni del produttore, versare in stoviglie da 35 mm e lasciarlo polimerizzare durante la notte su una superficie piana. L'elastomero contenente piatti di dissezione deve essere utilizzato per proteggere le punte sottili della sezionatura delle forcep, che possono essere facilmente danneggiate se viene effettuato un contatto tra le forcep e una superficie più dura, come un piatto di vetro. Acquistiamo regolarmente anche piatti rivestiti in silicone disponibili in commercio presso i rivenditori online. Per aumentare il contrasto durante le dissezioni, sono particolarmente utili le stoviglie di dissezione dell'elastomero siliconico contenenti carbone inattivato (e quindi di colore nero).

2. Procedura di dissezione cerebrale per adulti

  1. Anestetizzare D. melanogaster adulto di 3 - 5 giorni con CO2 o usando ghiaccio. Se si utilizza il ghiaccio, posizionare il flaconcino contenente mosche capovolte (tappare l'estremità verso il basso) in un secchio di ghiaccio per ~ 5 minuti. Posizionare la fiala nel ghiaccio a testa in giù impedisce alle mosche di essere depositate nel cibo. Una volta che le mosche sono state anestetizzate, posizionare le mosche su un cuscinetto di metallo freddo o una piastra di Petri seduta nel ghiaccio o su un fly pad che emette CO2. Se si sezionano cervelli per analizzare la neurodegenerazione, possono essere utilizzate anche mosche più vecchie.
  2. Posizionare una piccola quantità (150 - 200 μL) di PTN al centro della piastra di dissezione utilizzando una pipetta di trasferimento o una pipetta p200 per creare una "bolla" di PTN. Posizionare la parasezione sotto lo stereomicroscopio e regolare l'illuminazione e la messa a fuoco in modo che la bolla di PTN riempia il campo visivo e sia illuminata uniformemente.
  3. Manipolare le mosche in modo che siano "pancia in su" (cioè, lato ventraleverso l'alto) mentresono sdraiate sul metallo o sul pad di CO2.
  4. Usando un paio di #5, afferrare l'addome di una mosca da sezionare e, tenendo in mano la mosca, immergerla completamente nel PTN sul piatto di dissezione.
    NOTA: Per il resto del protocollo, tutti i passaggi devono essere eseguiti mentre la testa è immersa in PTN.
  5. Usando una seconda coppia di #5, afferrare la base della proboscide di mosca e tirare separate le due coppie di forcep per staccare la testa di mosca dal corpo. Scartare l'addome e il torace. Durante questo passaggio, è fondamentale che la testa non sia rilasciata e possa galleggiare sulla superficie del PTN. Una volta che la testa galleggia, può essere molto difficile da afferrare di nuovo senza schiacciare il cervello.
    NOTA: Usando questo metodo, le connessioni tra il cervello e il cordone nervoso ventrale vengono recise. Se sono necessarie connessioni intatte tra queste regioni del SNC, è necessario seguire un protocollo alternativo di dissezione. Se la proboscide si stacca dalla testa della mosca prima che la testa venga rimossa, ci sarà un buco dove si trovava la proboscide. In questo caso, afferrare la testa della mosca sul bordo del foro vicino a un occhio. Quindi rimuovere la testa usando una moderata quantità di forza mentre si allontanano le due coppie di forcep l'una dall'altra. Occasionalmente, quando la testa viene rimossa dal corpo, l'intestino e /o il cordone nervoso ventrale rimangono attaccati alla testa e devono essere rimossi prima di continuare la dissezione.
  6. Mentre una coppia di forcep afferra la proboscide, la seconda coppia dovrebbe afferrare il bordo mediale dell'occhio di mosca destro. Lentamente, allontanare le forcep l'una dall'altra. Questo passaggio deve essere eseguito con una piccola quantità di forza laterale costante. Mentre le forcep si allontanano lentamente l'una dall'altra, la proboscide dovrebbe allontanarsi dalla testa e creare un foro centrale nella cuticola della testa. Scartare la proboscide con la prima coppia di forcep senza rilasciare la porzione mediale dell'occhio destro dalla seconda coppia.
    NOTA: Il cervello adulto di D. melanogaster si trova nella regione caudale(cioèposteriore / posteriore) della testa di mosca. Pertanto, afferrare quella regione della testa dovrebbe essere evitato. Idealmente, solo la parterostrale (cioèanteriore) della testa vicino alla retina mediale dovrebbe essere afferrata direttamente dalle forcep. Il cervello e la trachea associata dovrebbero ora essere visibili attraverso il buco centrale nella cuticola. In questo momento, tutti i fili lanosi bianchi di trachea sporgenti dal foro possono essere rimossi e scartati.
  7. Con la seconda coppia di forcep, afferrare il bordo mediale della retina sinistra (sul bordo del foro centrale nella cuticola della testa). Per rimuovere le retine e la cuticola associata, allontanare lentamente le forcep l'una dall'altra con un angolo di 180°. Poiché la retina si dissocia dal lobo ottico sottostante, dovresti sentire una leggera diminuzione della tensione. Procedere lentamente per evitare di strappare il lobo ottico.
    NOTA: Separare le forcep troppo rapidamente durante questo passaggio può comportare lo strappo del lobo ottico o l'interruzione delle strutture del corpo dei funghi. Occasionalmente, la cuticola verrà rimossa ma pezzi della retina rimarranno attaccati al lobo ottico. Se si imagingno i corpi dei funghi, non è completamente necessario rimuovere l'intera retina. Tuttavia, l'analisi di altre regioni cerebrali (come l'innervazione neuronale retinica dei lobi cerebrali ottici) può richiedere che la retina sia completamente rimossa come descritto da.
    NOTA: Poiché la retina viene lentamente separata dal lobo ottico sottostante del cervello, il lobo ottico dovrebbe essere osservabile come una struttura bianca opaca ricoperta di trachea bianca e filante. Una volta rimossa una retina, può essere scartata. Quando si analizza il pathfinding dei neuroni retini, durante questo passaggio si deve prestare particolare attenzione per prevenire danni al lobo ottico. È disponibile anche un protocollo aggiuntivo incentrato sulla dissezione e l'imaging dal vivo dei neuroni fotorecettore.
  8. Ora, rimuovere con cura la maggior parte possibile della trachea visibile. La trachea può già contenere o successivamente riempire d'aria, causando il galleggiamento del cervello e, potenzialmente, la perdita durante i successivi passaggi di immunosottenzione. Per rimuovere la trachea, raccoglila dal cervello usando un paio di #5 forti.
  9. Rimuovere la retina rimanente e la cuticola circostante usando entrambe le coppie di forcep per afferrare la regione mediale della retina di mosca sinistra. Strappare con cura la retina a metà per rimuovere pezzi della retina e della cuticola. In alcuni casi, rimuovere la cuticola rimanente senza schiacciare il cervello si rivela particolarmente impegnativo. In questi casi, abbiamo scoperto che i restanti filamenti del cordone nervoso ventrale possono invece essere afferrati da una coppia di forcep mentre l'altra coppia di forcep viene utilizzata per rimuovere con cura l'ultimo della cuticola.
  10. Utilizzando una pipetta p200, spostare il cervello sezionato in un pozzo del piatto da 9 o 3 po 'contenente PTN. Cervelli dello stesso genotipo dovrebbero essere raggruppati nello stesso pozzo e tenuti sul ghiaccio. Il tessuto cerebrale deve essere fissato entro un'ora dalla dissezione. Il cervello può essere risolto in piccoli lotti e raggruppato se è necessario un numero maggiore di cervelli. Nella maggior parte dei casi, un ricercatore esperto di solito può sezionare un cervello e trasferirlo al piatto di raccolta del vetro in circa 3 - 5 minuti.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microdissection forceps/tweezers Ted Pella 505-NM
Sylgard dishes Living Systems Instrumentation DD-50-S-BLK Available from amazon.com
Na Phosphate Buffer monobasic Sigma S3139
Triton X 100 Sigma X100-100ml
stereomicroscope Leica S6D with KL300 LED light source
9-well dish (spot plate) VWR 89090-482
35mm dish Genesee Scientific 32-103
Sylgard Fisher 50-366-794
Kimwipe Fisher 06-666
PTN Buffer 0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, Typically make up 0.5 L of 0.1M NaPhosphate buffer and aliquote 50ml at a time as needed

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Fonte: Kelly, S.M., et al. J. Vis. Exp. (2017).

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