Drosophila Adult Brain Dissection: Eine Methode in der Fliegen-Neurobiologie

Overview

Dieses Video beschreibt, wie man das erwachsene Drosophila Gehirn sezieren und isolieren – ein Verfahren, das für die Visualisierung des Organs notwendig ist, das ansonsten durch das Nagelhaut-, Augen- und Trachealgewebe verdeckt wird. Das Beispielprotokoll zeigt eine detaillierte Demonstration, die hochwertige Präparate liefert, die für Immunfärbungs- und Bildgebungsmethoden in der Drosophila Neurobiologie verwendet werden können.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Kelly et al., Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains, J. Vis. Exp. (2017).

1. Dissektionsstation Vorbereitung

1. Positionieren Sie das Stereomikroskop und die Lichtquelle mit angeschlossenem Fiberoptik-Schwanenhals auf einer großen Tischplatte. Um stetige Handbewegungen zu fördern und das "Schütteln" der Hand beim Sezieren zu reduzieren, ist es wichtig, dass ein ausreichender Hand- und Armruheraum rund um das Mikroskop zur Verfügung steht. Stellen Sie sicher, dass es etwa 8 - 10 Zoll auf beiden Seiten des Mikroskops und 4 - 6 Zoll zwischen der Basis des Mikroskops und kante der Bank.
2. Füllen Sie 2 oder 3 Brunnen eines Glases 9-Well- oder 3-Well-Schale mit 1,0 ml PTN-Puffer (0,1 M Natriumphosphatpuffer pH 7,2, 0,1% nichtionisches Tensid, siehe Materialtabelle für komplette Pufferkomponenten) und neben der Trennstation auf Eis legen. Neu sezierte Gehirne werden auf diese Schale übertragen und bis zum Fixierungsschritt gespeichert.
   HINWEIS: Wenn Live-Bildgebung erforderlich ist, sollte der Sezierpuffer 1x Phosphat gepufferte Saline (PBS) oder HL3-Puffer sein. Wenn eine intrazelluläre Proteinlokalisierung erforderlich ist, kann PBS auch als alternativer Puffer für Diesektion und Fixierung verwendet werden. Nach der Fixierung sollte die Permeabilisierung der Zellmembranen dann mit PTN-Waschmitteln durchgeführt werden, die 0,1% oder 0,3% nichtionisches Reinigungsmittel enthalten.
   1. Wenn PBS für Sezierungen und Fixierung verwendet wird, sollten Pipettenspitzen mindestens einmal mit einem waschmittelhaltigen Puffer (z. B. PTN) gespült werden, um zu verhindern, dass Gehirne während des Transfers in Mikrozentrifugenrohre an den Kunststoffpipettenspitzen kleben.
3. Mit einer leeren 35 mm Glas- oder Kunststoff-Petrischale eine Sezierschale mit einem Silikonelastomer konstruieren. Kurz gesagt, mischen Sie die Elastomerkomponenten nach den Anweisungen des Herstellers, gießen Sie in 35 mm Geschirr, und lassen Sie es über Nacht auf einer flachen Oberfläche polymerisieren. Elastomer, das Seziergeschirr enthält, sollte verwendet werden, um die feinen Spitzen von Sezieren der Zange zu schützen, die leicht beschädigt werden kann, wenn der Kontakt zwischen den Zangen und einer härteren Oberfläche, wie z. B. einer Glasschale, hergestellt wird. Wir kaufen auch regelmäßig handelsübliche silikonbeschichtete Gerichte bei Online-Händlern. Um den Kontrast während der Sezierungen zu erhöhen, sind Silikonelastomer-Dissektionsschalen, die inaktivierte Holzkohle (und damit schwarz gefärbt) enthalten, besonders nützlich.

2. Adult Brain Dissection Verfahren

1. Anästhetisieren Sie 3 - 5 Tage alt Erwachsene D. melanogaster mit CO₂ oder mit Eis. Wenn Sie Eis verwenden, legen Sie die Durchstechflasche mit Fliegen kopfüber (Steckerende nach unten) in einen Eiskübel für 5 min. Wenn Sie die Durchstechflasche auf dem Kopf in Eis legen, können sich fliegende Fliegen nicht in der Nahrung absetzen. Sobald fliegen beäpft wurden, legen Sie die Fliegen auf ein kaltes Metallpad oder Petrischale sitzend in Eis oder auf einem CO₂ emittierenden Fliegenpad. Wenn Gehirne sezieren, um Neurodegeneration zu analysieren, können auch ältere Fliegen verwendet werden.
2. Legen Sie eine kleine Menge (150 - 200 L) PTN in die Mitte der Sezierschale mit einer Transferpipette oder einer p200 Pipette, um eine "Blase" von PTN zu erstellen. Legen Sie die Sezierschale unter das Stereomikroskop und stellen Sie die Beleuchtung und den Fokus so ein, dass die PTN-Blase das Sichtfeld füllt und gleichmäßig beleuchtet ist.
3. Manipulieren Sie Fliegen so, dass sie "bauchig"(d.h.ventrale Seite nach oben) sind, während sie auf dem Metall- oder_CO2-Pad liegen.
4. Mit einem Paar #5 Zangen, greifen Sie den Bauch einer Fliege zu sezieren und, halten Sie die Fliege, vollständig in der PTN auf der Sezierschale untertauchen.
   HINWEIS: Für den Rest des Protokolls sollten alle Schritte ausgeführt werden, während der Kopf in PTN getaucht wird.
5. Mit einem zweiten Paar #5 Zangen, greifen Sie die Basis der Fliege proboscis und ziehen Sie die beiden Paare von Zangen auseinander, um den Fliegenkopf vom Körper zu lösen. Entsorgen Sie den Bauch und den Thorax. Während dieses Schritts ist es wichtig, dass der Kopf nicht freigesetzt wird und auf der Oberfläche des PTN schweben darf. Sobald der Kopf schwebt, kann es sehr schwierig sein, wieder zu greifen, ohne das Gehirn zu zerquetschen.
   HINWEIS: Mit dieser Methode werden Verbindungen zwischen Gehirn und ventraler Nervenschnur getrennt. Wenn intakte Verbindungen zwischen diesen Bereichen des CNS erforderlich sind, sollte ein alternatives Sezierprotokoll befolgt werden. Wenn sich der Proboscis vom Fliegenkopf löst, bevor der Kopf entfernt wird, wird es ein Loch geben, in dem sich der Proboscis befand. Greifen Sie in diesem Fall den Fliegenkopf am Rand des Lochs in der Nähe eines Auges. Entfernen Sie dann den Kopf mit einer moderaten Menge an Kraft, während Sie die beiden Zangenpaare voneinander abziehen. Gelegentlich, wenn der Kopf aus dem Körper entfernt wird, bleibt der Darm und/oder die ventrale Nervenschnur am Kopf befestigt und sollte entfernt werden, bevor die Zerlegung fortgesetzt wird.
6. Während ein Zangenpaar den Proboscis erfasst, sollte das zweite Paar die mediale Kante des rechten Fliegenauges erfassen. Langsam die Zange voneinander ziehen. Dieser Schritt sollte mit einer kleinen Menge an stetiger Seitenkraft durchgeführt werden. Wenn sich die Zangen langsam voneinander entfernen, sollte sich der Proboscis vom Kopf entfernen und ein zentrales Loch in der Kopfhaut bilden. Entsorgen Sie den Proboscis mit dem ersten Zangenpaar, ohne den medialen Teil des rechten Auges vom zweiten Paar loszulassen.
   HINWEIS: Das erwachsene D. melanogaster Gehirn befindet sich im kaudalen(d.h.hinteren/hinteren) Bereich des Fliegenkopfes. Daher sollte vermieden werden, diese Region des Kopfes zu erfassen. Idealerweise sollte nur der rostrale(d.h.vordere) Teil des Kopfes in der Nähe der medialen Netzhaut direkt von den Zangen erfasst werden. Das Gehirn und die damit verbundene Luftröhre sollten nun durch das zentrale Loch in der Nagelhaut sichtbar sein. Zu diesem Zeitpunkt können alle weißen Stringy-Gewinde von Luftröhren, die aus der Bohrung herausragen, entfernt und verworfen werden.
7. Mit dem zweiten Zangenpaar greifen Sie die mediale Kante der linken Netzhaut (am Rand des zentralen Lochs in der Kopfhaut). Um die Netzhaut und die zugehörige Nagelhaut zu entfernen, ziehen Sie die Zange langsam in einem 180°-Winkel voneinander weg. Da sich die Netzhaut vom darunter liegenden Optischen Lappen löst, sollten Sie eine leichte Verspannung spüren. Fahren Sie langsam fort, um das Reißen des optischen Lappens zu verhindern.
   HINWEIS: Die zu schnelle Trennung der Zange während dieses Schritts kann zum Reißen des Optischen Lappens oder zu einer Störung der Pilzkörperstrukturen führen. Gelegentlich wird die Nagelhaut entfernt, aber Teile der Netzhaut bleiben am optischen Lappen befestigt. Wenn die Bildgebung der Pilzkörper, ist es nicht vollständig notwendig, die gesamte Netzhaut zu entfernen. Jedoch, Analyse von anderen Gehirnregionen (wie Retina-Neuron-Innervation der optischen Gehirnlappen) kann erfordern, dass die Netzhaut vollständig entfernt werden, wie von beschrieben.
   HINWEIS: Da die Netzhaut langsam vom darunter liegenden Sehlappen des Gehirns getrennt wird, sollte der optische Lappen als undurchsichtige weiße Struktur mit weißer, stringy Luftröhre bedeckt beobachtbar sein. Sobald eine Netzhaut entfernt wurde, kann sie entsorgt werden. Bei der Analyse der Pfadfindung von Netzhautneuronen sollte bei diesem Schritt besonders darauf geachtet werden, Schäden am Sehlappen zu verhindern. Ein zusätzliches Protokoll, das sich auf die Zerlegung und Live-Bildgebung der Photorezeptor-Neuronen konzentriert, ist ebenfalls verfügbar.
8. Entfernen Sie nun sorgfältig so viel wie möglich von der sichtbaren Luftröhre. Die Luftröhre kann bereits Luft enthalten oder später mit Luft füllen, wodurch Gehirne schweben und möglicherweise bei späteren Immunfärbungsschritten verloren gehen. Um Luftröhre zu entfernen, holen Sie es aus dem Gehirn mit einem sehr scharfen Paar #5 Zange.
9. Entfernen Sie die verbleibende Netzhaut und die umgebende Nagelhaut, indem Sie beide Zangenpaare verwenden, um den medialen Bereich der linken Fliegennetzhaut zu erfassen. Reißen Sie die Netzhaut vorsichtig in der Hälfte, um Teile der Netzhaut und Der Nagelhaut zu entfernen. In einigen Fällen erweist sich das Entfernen der verbleibenden Nagelhaut, ohne das Gehirn zu zerquetschen, als besonders schwierig. In diesen Fällen haben wir festgestellt, dass die verbleibenden Stränge der ventralen Nervenschnur stattdessen von einem Paar Zangen erfasst werden können, während das andere Zangenpaar verwendet wird, um die letzte Nagelhaut sorgfältig zu entfernen.
10. Mit einer p200 Pipette, bewegen Sie sezierte Gehirne zu einem Brunnen der 9- oder 3-Well-Schale, die PTN enthält. Gehirne des gleichen Genotyps sollten in den gleichen Brunnen gepoolt und auf Eis gehalten werden. Hirngewebe sollte innerhalb einer Stunde nach der Zerlegung fixiert werden. Gehirne können in kleinen Chargen fixiert und gepoolt werden, wenn eine größere Anzahl von Gehirnen erforderlich ist. In den meisten Fällen kann ein erfahrener Forscher in der Regel ein Gehirn sezieren und es in ca. 3 - 5 min auf die Glassammelschale übertragen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microdissection forceps/tweezers	Ted Pella	505-NM
Sylgard dishes	Living Systems Instrumentation	DD-50-S-BLK	Available from amazon.com
Na Phosphate Buffer monobasic	Sigma	S3139
Triton X 100	Sigma	X100-100ml
stereomicroscope	Leica S6D with KL300 LED light source
9-well dish (spot plate)	VWR	89090-482
35mm dish	Genesee Scientific	32-103
Sylgard	Fisher	50-366-794
Kimwipe	Fisher	06-666
PTN Buffer			0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, Typically make up 0.5 L of 0.1M NaPhosphate buffer and aliquote 50ml at a time as needed