Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Encyclopedia of Experiments

دروسوفيلا تشريح الدماغ الكبار: طريقة في علم الأعصاب يطير

Overview

يصف هذا الفيديو كيفية تشريح وعزل دماغ Drosophila البالغ - وهو إجراء ضروري لتصور العضو ، والذي يحجبه النسيج النسيجي والعين والقطلي. يظهر بروتوكول المثال عرضا تفصيليا يسفر عن تحضيرات عالية الجودة يمكن استخدامها لأساليب الإصابة بالمناعة والتصوير في البيولوجيا العصبية Drosophila.

Protocol

هذا البروتوكول هو مقتطف من كيلي وآخرون., تشريح وتلطيخ Immunofluorescent من الجسم الفطر والخلايا العصبية مستقبلات ضوئية في الكبار Drosophila melanogaster العقول, J. Vis. Exp. (2017).

1. إعداد محطة تشريح

  1. ضع المنظار المجسم ومصدر الضوء مع الألياف البصرية المرفقة goosenecks على سطح مقاعد البدلاء كبيرة. لتعزيز حركات اليد الثابتة والحد من "مصافحة" اليد أثناء التشريح ، من الضروري أن تتوفر مساحة كافية للراحة في اليد والذراع حول المجهر. تأكد من وجود ما يقرب من 8 - 10 بوصات على جانبي المجهر و 4 - 6 بوصات بين قاعدة المجهر وحافة المقعد.
  2. ملء 2 أو 3 آبار من الزجاج 9-جيدا أو 3-جيدا طبق مع 1.0 مل من PTN العازلة (0.1 M الصوديوم فوسفات العازلة pH 7.2, 0.1٪ السطحي غير المؤين, انظر جدول المواد لمكونات عازلة كاملة) ومكان بجوار محطة تشريح على الجليد. سيتم نقل الأدمغة التي تم تشريحها حديثا إلى هذا الطبق وتخزينها حتى خطوة التثبيت.
    ملاحظة: إذا كان التصوير الحي مطلوبا، يجب أن يكون المخزن المؤقت للتشريح 1x Phosphate Buffered Saline (PBS) أو المخزن المؤقت HL3. إذا كان مطلوبا توطين البروتين داخل الخلايا، ويمكن أيضا أن تستخدم برنامج تلفزيوني كحاجز بديل للتشريح والتثبيت. بعد التثبيت ، يجب إجراء permeabilization من أغشية الخلايا باستخدام يغسل PTN التي تحتوي على 0.1 ٪ أو 0.3 ٪ المنظفات غير المؤينة.
    1. إذا تم استخدام PBS للتشريح والتثبيت ، فيجب شطف نصائح ماصة مرة واحدة على الأقل بحاجز يحتوي على المنظفات (مثل PTN) لمنع الأدمغة من الالتصاق بنصائح ماصة بلاستيكية أثناء النقل إلى أنابيب الطرد الدقيق.
  3. باستخدام زجاج فارغ 35 ملم أو طبق بتري بلاستيكي، قم ببناء طبق تشريح يحتوي على إلاستومر سيليكون. لفترة وجيزة، مزيج مكونات الاستومر وفقا لتوجيهات الشركة المصنعة، تصب في أطباق 35 ملم، والسماح لها بلمرة بين عشية وضحاها على سطح مستو. يجب استخدام الإلستومر الذي يحتوي على أطباق تشريح لحماية النصائح الدقيقة لتشريح ملقط ، والتي يمكن أن تتلف بسهولة إذا تم الاتصال بين ملقط وسطح أصعب ، مثل طبق زجاجي. كما نقوم بانتظام بشراء أطباق مغلفة بالسيليكون متاحة تجاريا من تجار التجزئة عبر الإنترنت. لزيادة التباين أثناء التشريح ، فإن أطباق تشريح الاستومر السيليكونية التي تحتوي على الفحم المعطل (وبالتالي الأسود الملون) مفيدة بشكل خاص.

2. إجراء تشريح الدماغ الكبار

  1. تخدير 3 - 5 يوم البالغين من العمر D. melanogaster مع CO2 أو باستخدام الجليد. إذا كنت تستخدم الثلج، ضع القارورة التي تحتوي على الذباب رأسا على عقب (سد نهاية لأسفل) في دلو الثلج لمدة ~ 5 دقائق. وضع القارورة في الثلج رأسا على عقب يمنع الذباب من أن تصبح استقرت في الطعام. بمجرد تخدير الذباب ، ضع الذباب على وسادة معدنية باردة أو طبق بتري يجلس في الثلج أو علىمنصة ذبابة تنبعث منها ثاني أكسيد الكربون. إذا تشريح العقول لتحليل التنكس العصبي، الذباب الأكبر سنا يمكن أيضا أن تستخدم.
  2. ضع كمية صغيرة (150 - 200 ميكرولتر) من PTN في وسط طبق التشريح باستخدام ماصة نقل أو ماصة P200 لإنشاء "فقاعة" من PTN. وضع طبق تشريح تحت مجسم وضبط الإضاءة والتركيز بحيث فقاعة PTN يملأ مجال الرؤية ومضيئة بشكل موحد.
  3. التلاعب الذباب بحيث تكون "البطن حتى"(أي،الجانب البطني حتى) في حين الكذب على المعدن أوCO 2 وسادة.
  4. باستخدام زوج واحد من ملقط #5 ، فهم بطن ذبابة ليتم تشريحها ، والحفاظ على عقد من الذبابة ، وغمرها تماما في PTN على طبق تشريح.
    ملاحظة: بالنسبة لبقية البروتوكول، يجب تنفيذ كافة الخطوات أثناء غمر الرأس في PTN.
  5. باستخدام زوج ثان من ملقط #5 ، فهم قاعدة خرطوم الذبابة وسحب الزوجين من ملقط بصرف النظر لفصل رأس الذبابة عن الجسم. تجاهل البطن والصدر. خلال هذه الخطوة، من المهم أن الرأس لا يتم تحريرها ويسمح لتعويم على سطح PTN. بمجرد أن يطفو الرأس ، يمكن أن يكون من الصعب جدا فهمه مرة أخرى دون سحق الدماغ.
    ملاحظة: باستخدام هذه الطريقة، يتم قطع الاتصالات بين الدماغ والحبل العصبي البطني. إذا كانت الاتصالات سليمة بين هذه المناطق من CNS مطلوبة، يجب اتباع بروتوكول تشريح بديل. إذا انفصلت خرطوم من رأس الذبابة قبل إزالة الرأس، سيكون هناك ثقب حيث كان خرطوم. في هذه الحالة، فهم رأس الذبابة على حافة الحفرة بالقرب من عين واحدة. ثم إزالة الرأس باستخدام كمية معتدلة من القوة في حين سحب الزوجين من ملقط وبصرف النظر عن بعضها البعض. في بعض الأحيان ، عندما تتم إزالة الرأس من الجسم ، يبقى الأمعاء و / أو الحبل العصبي البطني ملتصقا بالرأس ويجب إزالته قبل مواصلة التشريح.
  6. في حين أن زوج واحد من ملقط يمسك خرطوم، يجب على الزوج الثاني فهم الحافة الوسيطة للعين ذبابة الحق. ببطء، سحب ملقط وبصرف النظر عن بعضها البعض. وينبغي تنفيذ هذه الخطوة مع كمية صغيرة من قوة ثابتة الجانبية. كما ملقط تتحرك ببطء وبصرف النظر عن بعضها البعض، وينبغي سحب خرطوم بعيدا عن الرأس وخلق ثقب مركزي في لطيف الرأس. تجاهل خرطوم مع الزوج الأول من ملقط دون الإفراج عن الجزء الوسيط من العين اليمنى من الزوج الثاني.
    ملاحظة: الدماغ البالغ D. melanogaster في منطقة caudal(أيالخلفية / الخلفية) من رأس الذبابة. وبالتالي ، ينبغي تجنب استيعاب تلك المنطقة من الرأس. من الناحية المثالية ، يجب فقط استيعاب الجزء الوردي(أيالأمامي) من الرأس بالقرب من شبكية العين الوسيطة مباشرة بواسطة ملقط. يجب أن يكون الدماغ والرغامى المرتبطة به مرئية الآن من خلال الثقب المركزي في السفاح. في هذا الوقت ، يمكن إزالة أي خيوط بيضاء من القصبة الهوائية البارزة من الحفرة والتخلص منها.
  7. مع الزوج الثاني من ملقط، فهم الحافة الوسطى من شبكية العين اليسرى (على حافة الثقب المركزي في قطع الرأس). لإزالة شبكية العين والكتل المرتبطة بها، اسحب ملقط ببطء بعيدا عن بعضها البعض بزاوية 180 درجة. كما شبكية العين ينفصم عن الفص البصري الكامنة، يجب أن تشعر بانخفاض طفيف في التوتر. المضي قدما ببطء لمنع تمزق الفص البصري.
    ملاحظة: فصل ملقط بسرعة كبيرة جدا خلال هذه الخطوة قد يؤدي إلى تمزق الفص البصري أو تعطيل هياكل الجسم الفطر. في بعض الأحيان ، سيتم إزالة القطع ولكن أجزاء من شبكية العين ستظل متصلة بالفص البصري. إذا تصوير أجسام الفطر، فإنه ليس من الضروري تماما لإزالة شبكية العين بأكملها. ومع ذلك، قد يتطلب تحليل مناطق الدماغ الأخرى (مثل ت الداخلي العصبي الشبكي لفص الدماغ البصري) إزالة شبكية العين تماما كما هو موضح من قبل.
    ملاحظة: كما يتم فصل شبكية العين ببطء من الفص البصري الكامنة في الدماغ، وينبغي ملاحظة الفص البصري كبنية بيضاء مبهمة مغطاة بالقرية البيضاء، وترية. وبمجرد إزالة شبكية عين واحدة، يمكن التخلص منها. عند تحليل اكتشاف الخلايا العصبية الشبكية، يجب توخي الحذر بشكل خاص خلال هذه الخطوة لمنع تلف الفص البصري. بروتوكول إضافي يركز على تشريح والتصوير الحي للخلايا العصبية مستقبلات ضوئية متاح أيضا.
  8. الآن، وإزالة بعناية أكبر قدر ممكن من القصبة الهوائية مرئية. قد تحتوي القصبة الهوائية بالفعل على الهواء أو تملأه لاحقا ، مما يتسبب في طفو الأدمغة ، وربما فقدانها أثناء خطوات التشبع المناعي اللاحقة. لإزالة القصبة الهوائية، التقطه من الدماغ باستخدام زوج حاد جدا من ملقط #5.
  9. إزالة شبكية العين المتبقية والكفاح المحيطة بها باستخدام كل من أزواج من ملقط لفهم المنطقة المتوسطة من شبكية العين يطير اليسار. تمزق شبكية العين بعناية إلى نصفين لإزالة أجزاء من شبكية العين والكفاح. في بعض الحالات ، وإزالة القطع المتبقية دون سحق الدماغ يثبت تحديا خاصا. في هذه الحالات ، وجدنا أن الخيوط المتبقية من الحبل العصبي البطني يمكن الإمساك بها بدلا من ذلك من قبل زوج واحد من ملقط بينما يتم استخدام الزوج الآخر من ملقط لإزالة بعناية آخر من كتلة.
  10. باستخدام ماصة P200، نقل العقول تشريح إلى بئر واحد من طبق 9-أو 3-جيدا التي تحتوي على PTN. وينبغي تجميع أدمغة من نفس النمط الجيني معا في نفس البئر وأبقى على الجليد. يجب إصلاح أنسجة الدماغ في غضون ساعة واحدة من التشريح. يمكن إصلاح الأدمغة على دفعات صغيرة وتجميعها إذا كان هناك حاجة إلى عدد أكبر من العقول. في معظم الظروف ، يمكن للباحث ذو الخبرة عادة تشريح الدماغ ونقله إلى طبق جمع الزجاج في حوالي 3 -5 دقائق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microdissection forceps/tweezers Ted Pella 505-NM
Sylgard dishes Living Systems Instrumentation DD-50-S-BLK Available from amazon.com
Na Phosphate Buffer monobasic Sigma S3139
Triton X 100 Sigma X100-100ml
stereomicroscope Leica S6D with KL300 LED light source
9-well dish (spot plate) VWR 89090-482
35mm dish Genesee Scientific 32-103
Sylgard Fisher 50-366-794
Kimwipe Fisher 06-666
PTN Buffer 0.1M NaPhosphate, pH 7.2, 0.1% Triton-X-100, Typically make up 0.5 L of 0.1M NaPhosphate buffer and aliquote 50ml at a time as needed

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Tags

قيمة فارغة، مشكلة ،
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter