Verarbeitung von Insektenbeinen für die Fluoreszenzmikroskopie: Eine Methode zur Erhaltung neuromuskulärer Strukturen für die Bildgebung

Overview

Dieses Video beschreibt eine Methode, um das Drosophila Erwachsenenbein zu sezieren, zu fixieren und zu montieren, während seine Neuromuskulatur für die bildgebende Analyse intakt bleibt.

Protocol

Dieses Protokoll ist ein Auszug aus Guan et al., Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle, J. Vis. Exp. (2018).

1. Beinsektion und Fixierung

1. Nehmen Sie eine Glas-Multi-Well-Platte und füllen Sie die entsprechende Anzahl von Brunnen mit 70% Ethanol. Fügen Sie 15–20 CO2-anästhetisierte Fliegen (entweder Geschlecht und jedes Alter) zu jedem Brunnen hinzu und mit einem Pinsel die Fliegen vorsichtig in die Ethanollösung zu tappen, bis die Fliegen vollständig unterGetaucht sind.
   HINWEIS: Dieser Schritt ist es, die Hydrophobie der Nagelhaut zu entfernen. Waschen Sie nicht mehr als 1 min, da dies die Autofluoreszenz der Nagelhaut erhöht.
2. Spülen Sie die Fliegen 3 mal mit 0,3% nichtionischer Tensid-Reinigungslösung in 1x Phosphat gepufferter Saline (PBS). Halten Sie die Fliegen in dieser Lösung für mindestens 10 min.
   HINWEIS: Die Beine sind besser fixiert, wenn Waschmittel, die wahrscheinlich die Penetration des Fixativs im Inneren des Beins zu erhöhen.
3. Legen Sie eine Multi-Well-Platte auf das Eis zusammen mit einem Rohr von 4% Paraformaldehyd (PFA).
   HINWEIS: Die Herstellung von frischen 4% PFA aus einer 16% PFA Ethanol freien Lagerlösung ist entscheidend.
4. Verwenden Sie Zangen, um den Kopf und Bauch der Fliegen zu entfernen, ohne das Brustsegment oder die Beine zu beschädigen.
   HINWEIS: Das Entfernen des Bauches macht es einfacher, die Fliege zu halten und die Beine zu sezieren.
5. Sezieren Sie die Beine aus dem Brustsegment mit Zangen und legen Sie die Beine in die Brunnen mit 4% PFA. Drücken Sie dazu vorsichtig, aber fest an der Coxa-Thorax-Kreuzung mit der Spitze feiner Zangen, bis sich das Bein löst.
6. Fixieren Sie die Beine in 4% PFA über Nacht bei 4 °C (ca. 20 h insgesamt).
7. Waschen Sie die Beine mit 0,3% nichtionischer Tensid-Reinigungslösung in 1x PBS, 5x für je 20 min.
8. Ersetzen Sie den Waschpuffer durch ein Montagemedium. Halten Sie das Bein mindestens einen Tag vor der Montage im Montagemedium, um ein vollständiges Eindringen in das Bein zu ermöglichen.
   HINWEIS: Wenn das Montagemedium hochviskos ist, verdünnen Sie das Montagemedium auf 80% mit 1x PBS, da die plötzliche Änderung der Viskosität dazu führen kann, dass die Nagelhaut zusammenbricht und die Gesamtstruktur des Beins beschädigt. Je nach Gal4-Treiber können Fliegen bis zur Montage 1 bis 3 Wochen bei 4 °C in Montagemedien aufbewahrt werden.

2. Beinmontage

1. Legen Sie ca. 20 l 70% Glycerin auf die linke Seite eines Mikroskopschlittens und decken Sie mit einem quadratischen 22 x 22 mm² Deckslip ab (Abbildung 1A,B). Rohrleitung ca. 10 l Montagemedium entlang einer Linie parallel zum und in einem kleinen Abstand vom rechten Rand dieses Deckschlips. Fügen Sie weitere 30 L Montagemedium weiter auf der rechten Seite des Dias hinzu (Abbildung 1C).
   HINWEIS: Beim Auftragen eines Coverslips über die Beine (siehe unten) breitet sich das Montagemedium sanft unter dem Deckelund um die Beine aus, ohne sie zu verdrängen.
2. Heben Sie das Bein mit feinen Zangen aus der Lösung und legen Es vorsichtig auf das Montagemedium in der Nähe des linken Deckelrutsches. Tun Sie dasselbe für jedes Bein und richten Sie sie von oben nach unten aus (Abbildung 1D).
   1. Heben und übertragen Sie die Beine in einem Tropfen Medium zwischen beiden Spitzen der Zange gehalten. Richten Sie die Beine auf zwei Arten aus: Außenseite nach oben oder unten.
3. Sobald alle Beine (bis zu 6–8 Beine können richtig ausgerichtet sind) richtig ausgerichtet sind, legen Sie einen zweiten Coverslip über die Beine, so dass dieser Coverslip leicht auf dem zuvor platzierten Coverslip Figur 1E ruht, um Platz zwischen dem Deckelund dem Gewebe zu schaffen und zu verhindern, dass die Beine beschädigt werden (Abbildung 1G).
   HINWEIS: Alternativ können Sie Aufkleberbrunnen oder kieferorthopädisches Wachs verwenden, um Platz zwischen dem Deckblatt und dem Dia zu schaffen.
4. Verwenden Sie einen Nagellack, um die Position der Abdeckungen an jeder Ecke zu sichern (Abbildung 1F).
   HINWEIS: Das Gewebe ist nun bereit zu bilden.

Representative Results

Abbildung 1: Verfahren zum Befestigen von Beinen auf Mikroskopschlitten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol absolute	Fisher	E/6550DF/17	Absolute analytical reagent grade
nonionic surfactant detergent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100, for molecular biology
Fine forceps	Sigma-Aldrich	F6521	Jewelers forceps, Dumont No. 5
Glass multi-well plate	Electron Microscopy Sciences	71563-01	9 cavity Pyrex, 100 mm x 85 mm
PFA	Thermofisher	28908	Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free
Glycerol	Fisher BioReagents	BP 229-1	Glycerol (Molecular Biology)
Spacers	Sun Jin Lab Co	IS006	iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep
Square 22 mm x 22 mm coverslips	Fisher Scientific	FIS#12-541-B	No. 1.5-0.16 to 0.19 mm thick
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Vectashield Antifade Mounting Medium