עיבוד רגלי חרקים למיקרוסקופיה פלואורסצנטית: שיטה לשימור מבנים נוירומוסקולריים להדמיה

Overview

סרטון זה מתאר שיטה לנתח, לתקן ולהרכיב את הרגל הבוגרת של דרוזופילה תוך שמירה על הנוירו-ממוסקולטורה שלה ללא פגע לצורך ניתוח הדמיה.

Protocol

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך גואן ואח '.,לדמיין דרוזופילה רגל מוטורי נוירון אקסונים דרך קוטיקל למבוגרים, J. Vis. Exp. (2018).

1. ניתוח רגליים וקיבעון

1. קח צלחת זכוכית רב באר ולמלא את המספר המתאים של בארות עם 70% אתנול. הוסיפו 15-20 CO₂- זבובים מורדמים (מכל מין ובכל גיל) לכל באר ובאמצעות מברשת, טפו בעדינות את הזבובים לתמיסת האתנול עד שהזבובים שקועים במלואם.
   שים לב: צעד זה הוא להסיר את ההידרופוביות של הקוטיקל. אין לשטוף במשך יותר מ 1 דקות, כי זה מגביר פלואורסצנטיות אוטומטית של הקוטיקל.
2. לשטוף את הזבובים 3 פעמים עם 0.3% תמיסת חומר ניקוי פעילי שטח nonionic ב 1x פוספט אגירה מלוחים (PBS). שמור את הזבובים בפתרון זה לפחות 10 דקות.
   שים לב: הרגליים קבועות טוב יותר כאשר כוללים חומר ניקוי, אשר עשוי להגביר את החדירה של התיקון בתוך הרגל.
3. מניחים צלחת רב-באר על הקרח יחד עם צינור של 4% paraformaldehyde (PFA).
   שים לב: הכנת PFA טרי 4% מפתרון 16% PFA אתנול חינם מניות הוא קריטי.
4. השתמש מלקחיים כדי להסיר את הראש והבטן של הזבובים מבלי לפגוע בקטע בית החזה או הרגליים.
   שים לב: הסרת הבטן מקלה על החזקת הזבוב ותנתח את הרגליים.
5. לנתח את הרגליים ממקטע בית החזה עם מלקחיים ומניחים את הרגליים בבארות המכילות 4% PFA. בשביל זה, לדחוף בעדינות אבל בחוזקה בצומת קוקסה בית החזה באמצעות קצה של מלקחיים עד הרגל מתנתקת.
6. לתקן את הרגליים ב 4% PFA לילה ב 4 מעלות צלזיוס (כ 20 שעות בסך הכל).
7. לשטוף את הרגליים עם 0.3% פתרון חומר ניקוי פעילי שטח nonionic ב 1x PBS, 5x במשך 20 דקות כל אחד.
8. החלף את מאגר הכביסה במדיום הרכבה. שמור את הרגל בהרכבה בינונית לפחות יום לפני ההרכבה כדי לאפשר חדירה מלאה שלה לתוך הרגל.
   שים לב: אם מדיום ההרכבה צמיג מאוד, לדלל את המדיום הרכבה ל 80% עם 1x PBS כי השינוי הפתאומי צמיגות יכול לגרום קוטיקולה לקרוס ולפגוע במבנה הכולל של הרגל. בהתאם לנהג Gal4, זבובים יכולים להישמר במשך שבוע עד 3 שבועות ב 4 מעלות צלזיוס במדיה הרכבה עד הרכבה.

2. הרכבה על הרגליים

1. מניחים כ-20 μL של 70% גליצרול בצד שמאל של שקופית מיקרוסקופ ומכסים בריבוע 22 x 22 מ"מ² כיסויים(איור 1A,B). פיפטה על 10 μL של מדיום הרכבה לאורך קו מקביל ובמרחק קטן מהקצה הימני של כיסוי זה. הוסיפו עוד 30 μL של מדיום הרכבה בצד ימין של השקופית (איור 1C).
   שים לב: בעת החלת כיסוי על הרגליים (ראה להלן) מדיום ההרכבה יתפשט בעדינות מתחת לכיסוי וסביב הרגליים מבלי לעקור אותם.
2. באמצעות מלקחיים עדינים להרים את הרגל מן הפתרון בעדינות לשים אותו על מדיום הרכבה ליד מכסה שמאל. עשו את אותו הדבר עבור כל רגל ויישרו אותן מלמעלה למטה (איור 1D).
   1. להרים ולהעביר את הרגליים בטיפה של בינוני מוחזק בין שני קצות המלקחיים. לכוון את הרגליים בשתי דרכים: צד חיצוני למעלה או למטה.
3. לאחר שכל הרגליים (עד 6-8 רגליים ניתן להרכיב) מיושרות כראוי, לשים כיסוי שני על הרגליים, כך כיסוי זה נשען מעט על כריכות להציב בעבר איור 1E כדי לאפשר רווח בין כריכה לרקמה ולמנוע את הרגליים מלהיות פגום (איור 1G).
   שים לב: לחלופין, השתמש בארות מדבקה או שעווה אורתודונטית כדי ליצור רווח בין coverslip ואת השקופית.
4. השתמשו בלק כדי להבטיח את מיקום הכיסויים בכל פינה (איור 1F).
   שים לב: הרקמה מוכנה כעת לתמונה.

Representative Results

איור 1: הליך להרכבת רגליים על שקופיות מיקרוסקופ. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol absolute	Fisher	E/6550DF/17	Absolute analytical reagent grade
nonionic surfactant detergent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100, for molecular biology
Fine forceps	Sigma-Aldrich	F6521	Jewelers forceps, Dumont No. 5
Glass multi-well plate	Electron Microscopy Sciences	71563-01	9 cavity Pyrex, 100 mm x 85 mm
PFA	Thermofisher	28908	Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free
Glycerol	Fisher BioReagents	BP 229-1	Glycerol (Molecular Biology)
Spacers	Sun Jin Lab Co	IS006	iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep
Square 22 mm x 22 mm coverslips	Fisher Scientific	FIS#12-541-B	No. 1.5-0.16 to 0.19 mm thick
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Vectashield Antifade Mounting Medium