Bearbetning av insektsben för fluorescensmikroskopi: En metod för att bevara neuromuskulära strukturer för avbildning

Overview

Denna video beskriver en metod för att dissekera, fixa och montera Drosophila vuxna benet samtidigt bevara dess neuromusculature intakt för bildframställning analys.

Protocol

Detta protokoll är ett utdrag från Guan et al., Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle, J. Vis. Exp. (2018).

1. Bendesektion och fixering

1. Ta en glasplatta med flera brunnar och fyll lämpligt antal brunnar med 70% etanol. Tillsätt 15–20 CO₂-sövda flugor (av båda könen och alla åldrar) till varje brunn och genom att använda en borste, doppa försiktigt flugorna i etanollösningen tills flugorna är helt nedsänkta.
   OBS: Detta steg är att ta bort nagelbandets hydrofobi. Tvätta inte i mer än 1 min, eftersom detta ökar nagelbandets autofluorescens.
2. Skölj flugorna 3 gånger med 0,3% nonionic tensid tvättmedel lösning i 1x fosfat buffrad saltlösning (PBS). Håll flugorna i denna lösning i minst 10 min.
   OBS: Benen är bättre fixerade när du inkluderar tvättmedel, vilket sannolikt kommer att öka penetrationen av fixativet inuti benet.
3. Placera en multibrunnsplatta på isen tillsammans med ett rör på 4% paraformaldehyd (PFA).
   OBS: Beredningen av färsk 4% PFA från en 16% PFA etanolfri lagerlösning är avgörande.
4. Använd tång för att ta bort flugornas huvud och buk utan att skada bröstsegmentet eller benen.
   OBS: Att ta bort buken gör det lättare att hålla flugan och dissekera benen.
5. Dissekera benen från bröstsegmentet med tång och placera benen i brunnarna som innehåller 4% PFA. För detta, tryck försiktigt men stadigt vid coxa-thorax-korsningen med hjälp av spetsen av fina tångar tills benet lossnar.
6. Fixera benen i 4% PFA över natten vid 4 °C (cirka 20 h totalt).
7. Tvätta benen med 0,3% nonionic tensid tvättmedel lösning i 1x PBS, 5x för 20 min vardera.
8. Byt ut tvättbufferten mot monteringsmedium. Håll benet i monteringsmedium i minst en dag före montering för att möjliggöra dess fullständiga penetration i benet.
   OBS: Om monteringsmediet är mycket trögflytande, späd monteringsmediet till 80% med 1x PBS eftersom den plötsliga förändringen i viskositet kan orsaka att nagelbandet kollapsar och skadar benets övergripande struktur. Beroende på Gal4-föraren kan flugor bevaras i 1 till 3 veckor vid 4 °C i monteringsmedia tills de monteras.

2. Benmontering

1. Placera cirka 20 μL 70 % glycerol på vänster sida av en mikroskoprutschbana och täck med en kvadrat på 22 x 22 mm² täcken (figur 1A,B). Pipett ca 10 μL monteringsmedium längs en linje parallellt med och på ett litet avstånd från den högra kanten av detta täckskydd. Tillsätt ytterligare 30 μL monteringsmedium ytterligare på höger sida av bilden (bild 1C).
   OBS: Vid applicering av ett täckglas över benen (se nedan) sprids monteringsmediet försiktigt under täcket och runt benen utan att förskjuta dem.
2. Använd fina tångar lyft benet från lösningen och lägg det försiktigt på monteringsmediet nära det vänstra täcket. Gör samma sak för varje ben och justera dem uppifrån och ned (Bild 1D).
   1. Lyft och överför benen i en droppe medium som hålls mellan båda spetsarna på tången. Orientera benen på två sätt: utvändig sida upp eller ner.
3. När alla ben (upp till 6–8 ben kan monteras) är ordentligt i linje, sätt ett andra lock över benen så att detta täcksår vilar något på det tidigare placerade täcket Figur 1E för att ge utrymme mellan täcket och vävnaden och för att förhindra att benen skadas ( Figur1G).
   OBS: Alternativt kan du använda klistermärkesbrunnar eller tandregleringsvax för att skapa utrymme mellan täckglaset och bilden.
4. Använd ett nagellack för att säkra kåporna i varje hörn (Bild 1F).
   OBS: Vävnaden är nu redo att avbilda.

Representative Results

Figur 1: Förfarande för montering av ben på mikroskoprutschbanor. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol absolute	Fisher	E/6550DF/17	Absolute analytical reagent grade
nonionic surfactant detergent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100, for molecular biology
Fine forceps	Sigma-Aldrich	F6521	Jewelers forceps, Dumont No. 5
Glass multi-well plate	Electron Microscopy Sciences	71563-01	9 cavity Pyrex, 100 mm x 85 mm
PFA	Thermofisher	28908	Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free
Glycerol	Fisher BioReagents	BP 229-1	Glycerol (Molecular Biology)
Spacers	Sun Jin Lab Co	IS006	iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep
Square 22 mm x 22 mm coverslips	Fisher Scientific	FIS#12-541-B	No. 1.5-0.16 to 0.19 mm thick
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Vectashield Antifade Mounting Medium