फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के लिए कीट पैरों को संसाधित करना: इमेजिंग के लिए न्यूरोमस्कुलर संरचनाओं को संरक्षित करने की एक विधि

Overview

यह वीडियो इमेजिंग विश्लेषण के लिए बरकरार अपने न्यूरोमस्कुलेचर को बनाए रखते हुए ड्रोसोफिला वयस्क पैर को विच्छेदन, ठीक करने और माउंट करने की विधि का वर्णन करता है।

Protocol

यह प्रोटोकॉल गुआन एट अलसे एक अंश है, वयस्क क्यूटिकल, जे विस एक्सपी (2018) के माध्यम से ड्रोसोफिला लेग मोटर न्यूरॉन एक्सॉन की कल्पना करें।

1. लेग विच्छेदन और निर्धारण

1. एक ग्लास मल्टी-वेल प्लेट लें और 70% इथेनॉल के साथ उचित संख्या में कुओं को भरें। प्रत्येक अच्छी तरह से और ब्रश का उपयोग_{करके,}मक्खियों को इथेनॉल समाधान में धीरे-धीरे डब करें जब तक मक्खियों पूरी तरह से जलमग्न न हो जाएं।
   नोट: यह कदम क्यूटिकल की हाइड्रोफोबसिटी को दूर करने के लिए है। 1 मिनट से अधिक समय तक न धोएं, क्योंकि इससे क्यूटिकल का ऑटो फ्लोरेसेंस बढ़ता है।
2. 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में 0.3% नॉनएनिक सर्फेक्टेंट डिटर्जेंट समाधान के साथ मक्खियों को 3 बार कुल्ला। इस घोल में मक्खियों को कम से कम 10 मिनट तक रखें।
   नोट: डिटर्जेंट सहित पैर बेहतर तय होते हैं, जिससे पैर के अंदर फिक्स्ड के प्रवेश में वृद्धि होने की संभावना होती है।
3. 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) की ट्यूब के साथ बर्फ पर एक मल्टी-वेल प्लेट रखें।
   नोट: 16% पीएफए इथेनॉल फ्री स्टॉक सॉल्यूशन से फ्रेश 4% पीएफए की तैयारी महत्वपूर्ण है।
4. वक्ष खंड या पैरों को नुकसान पहुंचाए बिना मक्खियों के सिर और पेट को हटाने के लिए संदंश का उपयोग करें।
   नोट: पेट को हटाने से मक्खी को पकड़ना और पैरों को काटना आसान हो जाता है।
5. संपीड़न के साथ वक्ष खंड से पैरों को विच्छेदन करें और पैरों को 4% पीएफए वाले कुओं में रखें। इसके लिए, पैर के टुकड़े होने तक ठीक संदंश की नोक का उपयोग करके कोक्सा-थोरेक्स जंक्शन पर धीरे-धीरे लेकिन दृढ़ता से पुश करें।
6. 4 डिग्री सेल्सियस (लगभग 20 घंटे कुल) पर रात भर 4% पीएफए में पैरों को ठीक करें।
7. 1x पीबीएस में 0.3% नॉनएनिक सर्फेक्टेंट डिटर्जेंट समाधान के साथ पैरों को धोएं, 20 मिनट के लिए 5x प्रत्येक।
8. बढ़ते माध्यम के साथ वाशिंग बफर की जगह। पैर में अपनी पूरी पैठ के लिए अनुमति देने के लिए बढ़ते माध्यम में पैर रखें कम से कम एक दिन पहले बढ़ते से पहले।
   नोट: यदि बढ़ते माध्यम अत्यधिक चिपचिपा है, 1x PBS के साथ 80% करने के लिए बढ़ते माध्यम पतला क्योंकि चिपचिपाहट में अचानक परिवर्तन छल्ली पतन के लिए और पैर की समग्र संरचना को नुकसान पहुंचा सकता है। Gal4 ड्राइवर के आधार पर, मक्खियों को बढ़ते मीडिया में 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 से 3 सप्ताह के लिए संरक्षित किया जा सकता है।

2. लेग माउंटिंग

1. माइक्रोस्कोप स्लाइड के बाएं हाथ की ओर 70% ग्लाइस्रोल के लगभग 20 माइक्रोन रखें और एक वर्ग 22 x 22 मिमी² कवरलिप(चित्रा 1ए, बी)के साथ कवर करें। इस कवरस्लिप के दाहिने किनारे से एक छोटी सी दूरी पर और समानांतर रेखा के साथ बढ़ते माध्यम के बारे में 10 माइक्रोन के बारे में पिपेट। स्लाइड के दाईं ओर आगे बढ़ते माध्यम का एक और 30 μL जोड़ें(चित्रा 1सी)।
   नोट: पैरों पर एक कवरस्लिप लागू करते समय (नीचे देखें) बढ़ते माध्यम धीरे-धीरे कवरस्लिप के नीचे और पैरों के आसपास उन्हें विस्थापित किए बिना फैल जाएगा।
2. ठीक संदंश का उपयोग समाधान से पैर उठा और धीरे से यह बाईं कवरस्लिप के पास बढ़ते माध्यम पर डाल दिया । प्रत्येक पैर के लिए समान करें और उन्हें ऊपर सेनीचे (चित्रा 1डी)तक संरेखित करें।
   1. संदंश के दोनों सुझावों के बीच आयोजित माध्यम की एक बूंद में पैरों को उठाएं और स्थानांतरित करें। पैरों को दो तरीकों से उन्मुख करें: बाहरी पक्ष ऊपर या नीचे।
3. एक बार जब सभी पैरों (6-8 पैरों तक घुड़सवार किया जा सकता है) ठीक से गठबंधन कर रहे हैं, पैरों पर एक दूसरे कवरस्लिप डाल इस तरह कि इस कवरस्लिप पहले रखा कवरस्लिप चित्रा 1ई पर थोड़ा टिकी हुई है कवरस्लिप और ऊतक के बीच अंतरिक्ष के लिए अनुमति देने के लिए और पैरों को क्षतिग्रस्त होने से रोकने के लिए(चित्रा 1जी)।
   नोट: वैकल्पिक रूप से, कवरस्लिप और स्लाइड के बीच जगह बनाने के लिए स्टीकर कुओं या ऑर्थोडोन्टिक मोम का उपयोग करें।
4. प्रत्येक कोने(चित्रा 1एफ)पर कवरस्लिप की स्थिति को सुरक्षित करने के लिए नेल पॉलिश का उपयोग करें।
   नोट: ऊतक अब छवि के लिए तैयार है।

Representative Results

चित्रा 1: माइक्रोस्कोप स्लाइड पर पैर माउंट करने के लिए प्रक्रिया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol absolute	Fisher	E/6550DF/17	Absolute analytical reagent grade
nonionic surfactant detergent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100, for molecular biology
Fine forceps	Sigma-Aldrich	F6521	Jewelers forceps, Dumont No. 5
Glass multi-well plate	Electron Microscopy Sciences	71563-01	9 cavity Pyrex, 100 mm x 85 mm
PFA	Thermofisher	28908	Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free
Glycerol	Fisher BioReagents	BP 229-1	Glycerol (Molecular Biology)
Spacers	Sun Jin Lab Co	IS006	iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep
Square 22 mm x 22 mm coverslips	Fisher Scientific	FIS#12-541-B	No. 1.5-0.16 to 0.19 mm thick
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Vectashield Antifade Mounting Medium