RNAi האכלה בתרבות נוזלית: שיטת תפוקה גבוהה כדי להפיל ביטוי גנים C. elegans

Overview

RNAi הוא כלי גנטי רב עוצמה זמין לחוקרי C. elegans. וידאו זה מציג שיטה לטיפול תולעים יותר עם RNAi מאשר האכלת צלחת על ידי ניצול תנאי תרבות נוזלית.

Protocol

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Groh et al, שיטות לחקר שינויים בצבירת חלבונים אינהרנטית עם הגיל ב- Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2017).

1. תרבות נוזלית של בעלי חיים נטולי גונדות לאיסוף בעלי חיים צעירים ומזדקנים הנתונים ל- RNAi המכוון לגן מעניין

שים לב: התגובה של כמה גנים RNAi יכול להיות תלוי טמפרטורה כפי שתואר קודם לכן. כחלופה ל- RNAi, גן מוטנט יכול להיות משולב ברקע gon-2(-).

1. הכנת חיידקים לתרבות נוזלית
   1. הכן חיידקי OP50 ו- RNAi (חיידקים המייצרים את ה- dsRNA והחיידקים הרצויים עם הווקטור הריק כשליטה) על ידי אחסון מדיום 4 L LB עם 12 מ"ל של תרבות החיידקים המתאימה (הוסף ריכוז סופי של 50 מיקרוגרם / מ"ל קרבניצילין ו 1 מ"מ IPTG לתרביות החיידקיות RNAi) ודגור אותם ב 37 מעלות צלזיוס לילה ב 180 סל"ד
   2. למחרת לקצור את התרבויות ב 6,700 x g במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הסר את supernatants ו resuspend כל גלולה ב 60 מ"ל קר כקרח S בסיסי מדיה (100 mM NaCl, 50 מ"מ אשלגן פוספט pH 6, נשמר על קרח). שמור את שלושת כדורי resuspended (OP50, שליטה RNAi חיידקים, ו RNAi חיידקים עבור הגן של עניין) ב 4 מעלות צלזיוס עד שלב 1.2.
      שים לב: תולעים ניתן לגדל על RNAi משלב L1 או כדי למנוע פגמים התפתחותיים משלב הזחל האחרון L4 (ראה שלב 1.2).
2. תרבות נוזלית לטיפול עם RNAi החל בשלב הזחל האחרון L4
   1. הוסף 200 mL S מדיה בסיסית בבקבוק תרבות Fernbach (קיבולת 2,800 מ"ל). לנפח תרבות סופי של 300 מ"ל (ראה 1.2.2.4), הוסף 10 מ"מ אשלגן ציטראט, pH 6, 3 מ"ל עקבות מתכות פתרון (5 mM ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA), 2.5 mM FeSO₄, 1 mM MnCl₂, 1 מלמ"מ ZnSO₄, 0.1 מ"מ CuSO₄), 3 מ"מ MgSO₄, 3 מ"מ CaCl₂, 100 ng / mL קרבנדאזים, ו 5 מיקרוגרם / מ"ל כולסטרול). סגור את הבקבוק עם כובע בורג ממברנה. עיין בטבלה 1 לקבלת מתכונים של מאגרים.
   2. קח את L1s מתוך 25 מעלות צלזיוס ולהעביר אותם צינורות 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 1,900 x g במשך 3 דקות, להסיר את supernatant, ולספור את L1s לכל 2 μL. להוסיף 500,000 L1s לתוך בקבוק תרבות Fernbach מוכן בשלב הקודם.
   3. הוסף את OP50 (משלב 1.1) באופן פרופורציונלי למספר התולעים. לדוגמה, עבור 500,000 תולעים להוסיף 60 מ"ל OP50.
   4. תרבות תולעת מלאה עם S basal כדי להביא את הנפח הכולל ל 300 מ"ל. דגירה תרבות התולעת עד שלב L4 ב 25 °C (60 °F) באינקובטור רועד עם 150 סל"ד.
   5. למחרת, התולעים צריכות להיות בגודל של L4s מסוג פראי. כדי לעבור מ- OP50 לחיידקי RNAi, לאסוף בעלי חיים בשישה צינורות 50 מ"ל, לתת להם משקעים ולהסיר את supernatant. לשטוף את L4s עם M9 כדי להסיר שאריות חיידקים OP50: צנטריפוגה ב 1900 x g במשך 3 דקות, להסיר את supernatant ולהעביר את כל L4s לתוך צינור אחד 50 מ"ל. לספור את L4s לכל 5 μL (לפחות תשע פעמים). פעמיים נדרשים 50,000 L4s עבור אוסף התולעים הצעירות ופעמיים נדרשים 100,000 L4s לאיסוף התולעים המיושן.
   6. הכן ארבעה צלושי תרבות פרנבך כמתואר ב 1.2.2.1. הוסף גם ריכוז סופי של 50 מיקרוגרם / מ"ל קרבניצילין ו 1 מ"מ IPTG לכל בקבוקון.
   7. הוסף שליטה חיידקי RNAi וחיידקי RNAi עבור הגן של עניין (משלב 1.1) באופן פרופורציונלי למספר התולעים: להוסיף 7 מ"ל של חיידקים בהתאמה לכל בקבוק עבור תולעים צעירות ו 14 מ"ל לכל בקבוק עבור תולעים בגילאי.
   8. הוסיפו 50,000 תולעים לבקבוק לאוסף התולעים הצעיר ו-100,000 תולעים לבקבוק לאוסף התולעים המיושן, והשלמו את התרביות עם S basal למילוי של עד 300 מ"ל. דגירה תרביות התולעת (ארבעה בסך הכל) ב 25 °C (60 °F) ו 150 סל"ד.

2. תחזוקה של C. elegans תרבויות נוזליות

1. מעת לעת לאסוף aliquot מכל תרבות נוזלית ומניחים על שקופית זכוכית (לחילופין על צלחת אגר) כדי לוודא כי אין זיהומים. באמצעות מיקרוסקופ ניתוח, לבדוק את רמות המזון החיידקי בתרבות במיוחד בשלב הצמיחה. הכינו מראש 2 תרביות L של חיידקי RNAi וחיידקי RNAi לגן המעניין כמתואר בשלב 1.1. מוסיפים אותם C. elegans תרביות נוזלי במידת הצורך ולשמור את השאר ב 4 מעלות צלזיוס.
2. מעת לעת לבדוק כי בעלי החיים הם סטריליים. לרוב בעלי החיים לא יהיה גונד. בהתאם לחדירה של המוטציה gon-2, כמה אולי הפלת מבני האשכים אבל אין בעלי חיים עם ביצים יש לראות.

פתרון מלאי	כמות	ריכוז סופי	הערות/תיאור
S בזל (עבור 500 מ"ל: 5.9 גרם NaCl, 50 מ"ל 1 מ' אשלגן פוספט pH 6)	200 מ"ל		1 M אשלגן פוספט pH 6: עבור 1 L: 129 גרם KH2PO4 מונובאסית, 52 גר' K2HPO4 דיבסי נטול מים
1 מ' אשלגן ציטראט pH 6 (עבור 400 מ"ל: 13.1 גרם חומצת לימון מונוהידראט, 134.4 גרם תלת-אשלגן ציטראט מונוהידראט)	3 מ"ל	10 מ"מ
פתרון מתכות מעקב (עבור 1 L: 1.86 גרם חומצה אתילנדיאמינטית (EDTA), 0.69 גר' FeSO4 · 7 H2O, 0.2 גר' MnCl2 · 4 H2O, 0.29 גר' ZnSO4 · 7 H2O, 0.025 גרם CuSO4 · 5 H2O)	3 מ"ל		לאחסן פתרון מלאי בחושך ב 4 °C (69 °F)
1 M MgSO4 (עבור 500 מ"ל: 123.3 גרם)	900 μL	3 מ"מ
1 M CaCl2 (עבור 500 מ"ל: 73.5 גרם)	900 μL	3 מ"מ
200 מיקרוגרם/ מ"ל קרבנדזים (עבור 50 מ"ל: 10 מ"ג במתנול)	150 μL	100 ng/מ"ל
5 מ"ג / מ"ל כולסטרול (עבור 100 מ"ל: 0.5 גרם באתנול)	300 μL	5 מיקרוגרם/ מ"ל

שולחן 1.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fernbach culture flask	Corning	4425-2XL	Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents
Membrane Screw Cap	Schott	1E+06	GL45
Nutating Mixer	VWR	444-0148	yes
Separatory funnel	Nalgene	4300-1000	Capacity 1,000 ml
1 ml syringe	BD Plastipak	3E+05
Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm	BD Microlance 3	3E+05
Membrane filters 0.025 µM	Millipore	VSWP04700	no
pH strip	Machery-Nagel	92110	pH-Fix 0-14
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	5E+09	Complete Mini EDTA-free tablets
Octoxynol-9	Applichem	A1388	Triton X-100
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	M1317
Nonylphenylpolyethylenglycol	Applichem	A1694	Nonidet P40 (NP40)
DNaseI	Roche	5E+09	recombinant, RNase free
RNaseA	Promega	A7973	solution
Total protein blot staining	Thermofisher	S11791	Sypro Ruby protein blot stain
Total protein gel staining	Thermofisher	S12001	Sypro Ruby protein gel stain
TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride)	Serva	36970
Iodoacetamide	Serva	26710
Ammoniumbicarbonate	Sigma-Aldrich	9830
Sequencing Grade Modified Trypsin	Promega	V5111
Isobaric tags for relative and absolute quantitation	Sciex	4E+06	iTRAQ Reagents Multiplex Kit
Centrifuge Avanti J-26XP	Beckmann Coulter	4E+05
Ultracentrifuge Optima Max-XP	Beckmann Coulter	4E+05
Centrifuge 5424R	Eppendorf	5E+09
Centrifuge 5702	Eppendorf	6E+09
Centrifuge Megafuge 40R	Thermo Scientific	8E+07
Concentrator Plus	Eppendorf	5E+09	Centrifugal evaporator
Fluorescent stereo-microscope M165 FC	Leica		With Planapo 2.0x objective
Dissection microscope	Leica		Leica S6E
High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1	Zeiss		With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm
Software
Image analysis software	ImageJ
Analysis of mass spectrometry data	Protein Prospector	http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm	no
E.coli strains
OP50	CGC
RNAi bacteria
L4440	Julie Ahringer RNAi library
C. elegans mutants
CF2253	CGC, strain name: EJ1158	Genotype: gon-2(q388)
C. elegans transgenics
DCD214	Della David's lab at DZNE Tübingen	Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]
DCD215	Della David's lab at DZNE Tübingen	Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]