RNAi-voeding in vloeibare cultuur: een methode met hoge doorvoer om genexpressie in C. elegans neer te slaan

Overview

RNAi is een krachtig genetisch hulpmiddel dat beschikbaar is voor onderzoekers van C. elegans. Deze video introduceert een methode om meer wormen met RNAi te behandelen dan plaatvoeding door gebruik te maken van vloeibare kweekomstandigheden.

Protocol

Dit protocol is een uittreksel uit Groh et al, Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2017).

1. Vloeibare cultuur van geslachtsloze dieren om jonge en oudere dieren te verzamelen die onderworpen zijn aan RNAi gericht op een interessant gen

OPMERKING: De reactie van sommige genen op RNAi kan temperatuurafhankelijk zijn zoals eerder beschreven. Als alternatief voor RNAi kan een mutant gen worden opgenomen in de gon-2(-) achtergrond.

1. Bereiding van bacteriën voor vloeibare cultuur
   1. Bereid OP50- en RNAi-bacteriën (bacteriën die het gewenste dsRNA produceren en bacteriën met de lege vector als controle) door 4 L LB-medium met 12 ml van de respectieve bacteriecultuur te enten (voeg een eindconcentratie van 50 μg/ml carbenicilline en 1 mM IPTG toe aan de RNAi-bacterieculturen) en incubeer ze 's nachts bij 37 °C bij 180 tpm.
   2. Oogst de volgende dag de culturen op 6.700 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Verwijder de supernatanten en resuspend elke pellet in 60 ml ijskoude S basale media (100 mM NaCl, 50 mM kaliumfosfaat pH 6, op ijs gehouden). Houd de drie geresuspendeerde pellets (OP50, controle RNAi-bacteriën en RNAi-bacteriën voor het gen van belang) op 4 °C tot stap 1.2.
      OPMERKING: Wormen kunnen vanaf het L1-stadium op RNAi worden gekweekt of om ontwikkelingsdefecten van het laatste larvale stadium L4 te voorkomen (zie stap 1.2).
2. Vloeibare kweek voor behandeling met RNAi vanaf laatste larvale fase L4
   1. Voeg 200 ml S basale media toe in een Fernbach kweekkolf (inhoud 2.800 ml). Voeg voor een eindkweekvolume van 300 ml (zie 1.2.2.4) 10 ml kaliumcitraat toe, pH 6, 3 ml Spoormetalenoplossing (5 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), 2,5 mM FeSO_4,1 mM MnCl_2,1 mM ZnSO_4,0,1 mM CuSO_4),3 mM MgSO_4,3 mM CaCl_2,100 ng/ml carbendazim en 5 mL carbendazim). Sluit de kolf met een membraanschroefdop. Raadpleeg tabel 1 voor recepten van buffers.
   2. Neem de L1's van 25 °C en breng ze over op buizen van 15 ml. Centrifugeer gedurende 3 minuten op 1.900 x g, verwijder het supernatant en tel de L1's per 2 μL. Voeg 500.000 L1's toe aan de Fernbach kweekkolf die in de vorige stap is bereid.
   3. Voeg OP50 (vanaf stap 1.1) proportioneel toe aan het aantal wormen. Voor 500.000 wormen voegt u bijvoorbeeld 60 ml OP50 toe.
   4. Complete wormkweek met S-basaal om het totale volume op 300 ml te brengen. Incubeer de wormkweek tot het L4-stadium bij 25 °C in een schuddende incubator met 150 tpm.
   5. De volgende dag moeten de wormen zo groot zijn als L4's van het wilde type. Om van OP50 naar RNAi-bacteriën te veranderen, verzamelt u dieren in zes 50 ml-buizen, laat u ze bezinken en verwijdert u het supernatant. Was de L4's met M9 om de resterende OP50-bacteriën te verwijderen: centrifugeer gedurende 3 minuten op 1900 x g, verwijder het supernatant en breng alle L4's over in één 50 ml-buis. Tel de L4's per 5 μL (minstens negen keer). Twee keer 50.000 L4's zijn nodig voor de jonge wormcollectie en twee keer 100.000 L4's voor de oude wormcollectie.
   6. Bereid vier Fernbach kweekkolven zoals beschreven in 1.2.2.1. Voeg ook een eindconcentratie van 50 μg/ml carbenicilline en 1 mM IPTG toe aan elke kolf.
   7. Voeg controle RNAi-bacteriën en RNAi-bacteriën voor het interessegen (vanaf stap 1.1) proportioneel toe aan het aantal wormen: Voeg 7 ml van de respectieve bacteriën per kolf toe voor jonge wormen en 14 ml per kolf voor de oude wormen.
   8. Voeg 50.000 wormen per kolf toe voor de jonge wormenverzameling en 100.000 wormen per kolf voor de oude wormenverzameling en voltooi de culturen met S-basaal om tot 300 ml te vullen. Incubeer de wormculturen (vier in totaal) bij 25 °C en 150 tpm.

2. Onderhoud van C. elegans vloeibare culturen

1. Verzamel periodiek een aliquot van elke vloeibare cultuur en plaats deze op een glazen glijbaan (als alternatief op een agarplaat) om te controleren of er geen verontreinigingen zijn. Controleer met behulp van een dissectiemicroscoop de bacteriële voedselniveaus in de cultuur, vooral tijdens de groeifase. Bereid vooraf 2 L-culturen van controle RNAi-bacteriën en RNAi-bacteriën voor op het gen van belang zoals beschreven in stap 1.1. Voeg deze indien nodig toe aan C. elegans vloeibare culturen en houd de rest op 4 °C.
2. Controleer regelmatig of de dieren steriel zijn. De meerderheid van de dieren zal geen geslachtsklier hebben. Afhankelijk van de penetrantie van de gon-2-mutatie, kunnen sommige gonadale structuren hebben afgebroken, maar er mogen geen dieren met eieren worden waargenomen.

Voorraadoplossing	Bedrag	Eindconcentratie	Opmerkingen/Beschrijving
S basaal (Voor 500 ml: 5,9 g NaCl, 50 ml 1 M Kaliumfosfaat pH 6)	200 ml		1 M Kaliumfosfaat pH 6: Voor 1 L: 129 g KH2PO4 monobasisch, 52 g K2HPO4 dibasisch watervrij
1 M Kaliumcitraat pH 6 (Voor 400 ml: 13,1 g citroenzuurmonohydraat, 134,4 g trikaliumcitraatmonohydraat)	3 ml	10 mM
Oplossing voor sporenmetalen (Voor 1 L: 1,86 g Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA), 0.69 g FeSO4 · 7 H2O, 0,2 g MnCl2 · 4 H2O, 0.29 g ZnSO4 · 7 H2O, 0.025 g CuSO4 · 5 H2O)	3 ml		Bewaar voorraadoplossing in het donker bij 4 °C
1 M MgSO4 (Voor 500 ml: 123,3 g)	900 μL	3 mM
1 M CaCl2 (Voor 500 ml: 73,5 g)	900 μL	3 mM
200 μg/ml Carbendazim (Voor 50 ml: 10 mg in Methanol)	150 μL	100 ng/ml
5 mg/ml cholesterol (Voor 100 ml: 0,5 g ethanol)	300 μL	5 μg/ml

Tabel 1.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fernbach culture flask	Corning	4425-2XL	Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents
Membrane Screw Cap	Schott	1E+06	GL45
Nutating Mixer	VWR	444-0148	yes
Separatory funnel	Nalgene	4300-1000	Capacity 1,000 ml
1 ml syringe	BD Plastipak	3E+05
Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm	BD Microlance 3	3E+05
Membrane filters 0.025 µM	Millipore	VSWP04700	no
pH strip	Machery-Nagel	92110	pH-Fix 0-14
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	5E+09	Complete Mini EDTA-free tablets
Octoxynol-9	Applichem	A1388	Triton X-100
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	M1317
Nonylphenylpolyethylenglycol	Applichem	A1694	Nonidet P40 (NP40)
DNaseI	Roche	5E+09	recombinant, RNase free
RNaseA	Promega	A7973	solution
Total protein blot staining	Thermofisher	S11791	Sypro Ruby protein blot stain
Total protein gel staining	Thermofisher	S12001	Sypro Ruby protein gel stain
TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride)	Serva	36970
Iodoacetamide	Serva	26710
Ammoniumbicarbonate	Sigma-Aldrich	9830
Sequencing Grade Modified Trypsin	Promega	V5111
Isobaric tags for relative and absolute quantitation	Sciex	4E+06	iTRAQ Reagents Multiplex Kit
Centrifuge Avanti J-26XP	Beckmann Coulter	4E+05
Ultracentrifuge Optima Max-XP	Beckmann Coulter	4E+05
Centrifuge 5424R	Eppendorf	5E+09
Centrifuge 5702	Eppendorf	6E+09
Centrifuge Megafuge 40R	Thermo Scientific	8E+07
Concentrator Plus	Eppendorf	5E+09	Centrifugal evaporator
Fluorescent stereo-microscope M165 FC	Leica		With Planapo 2.0x objective
Dissection microscope	Leica		Leica S6E
High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1	Zeiss		With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm
Software
Image analysis software	ImageJ
Analysis of mass spectrometry data	Protein Prospector	http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm	no
E.coli strains
OP50	CGC
RNAi bacteria
L4440	Julie Ahringer RNAi library
C. elegans mutants
CF2253	CGC, strain name: EJ1158	Genotype: gon-2(q388)
C. elegans transgenics
DCD214	Della David's lab at DZNE Tübingen	Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]
DCD215	Della David's lab at DZNE Tübingen	Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]