Overview
RNAi는 C. elegans 연구원에 사용할 수 있는 강력한 유전 도구. 이 비디오는 액체 배양 조건을 활용하여 플레이트 공급보다 RNAi로 더 많은 벌레를 치료하는 방법을 소개합니다.
Protocol
이 프로토콜은 그로 외에서발췌, Caenorhabditis elegans에서나이와 고유 단백질 집계의 변화를 연구하는 방법, J. Vis. Exp. (2017).
1. 관심 유전자를 대상으로 RNAi를 대상으로 하는 젊고 숙성된 동물을 수집하는 고나드없는 동물의 액체 문화
참고: RNAi에 대한 일부 유전자의 반응은 이전에 설명된 바와 같이 온도에 의존할 수 있다. RNAi에 대한 대안으로, 돌연변이 유전자는 곤-2 (-) 배경으로 통합될 수 있었습니다.
- 액체 문화를 위한 박테리아의 준비
- OP50 및 RNAi 박테리아(빈 벡터를 가진 원하는 dsRNA 및 박테리아를 대조군으로 생산하는 박테리아)를 각 세균 배양의 12mL로 4 L LB 배지를 접종하여 준비합니다(RNAi 세균 배양에 50 μg/mL 카베니실린 및 1mM IPTG의 최종 농도를 추가) 및 37°Cpm에서 1mM MM IPTG를 접종하여 18°Cpm에서 10°C에 접종한다.
- 다음날 4°C에서 10분 동안 6,700 x g의 배양을 수확합니다. 슈퍼네이틴을 제거하고 60mL 얼음-차가운 S 기저미디어(100mM NaCl, 50mM 칼륨 인산염 pH 6, 얼음 위에 보관)에서 각 펠릿을 재연한다. 3개의 재중단 된 펠릿 (OP50, 제어 RNAi 박테리아 및 관심 유전자에 대한 RNAi 박테리아)를 4 °C에서 1.2 단계까지 유지하십시오.
참고: 벌레는 L1 단계에서 RNAi에서 재배하거나 마지막 애벌레 단계 L4에서 발달 결함을 피하기 위해 재배 할 수 있습니다 (단계 1.2 참조).
- 마지막 애벌레 단계 L4에서 시작 RNAi와 치료를위한 액체 문화
- 200mL S 기저 미디어를 Fernbach 문화 플라스크(용량 2,800mL)에 추가합니다. 300mL의 최종 배양량(1.2.2.4 참조)의 경우 10mM 의 구연산칼륨을 추가, pH 6, 3mL 미트레이스 금속 용액(5mM 에틸렌디아민테트라아세틱산(EDTA), 2.5m MM FeSO4,1mM MnCl2,1mM ZnSO4,0.1 mM CuSO4),3m MM MgSO4,3mM CaCl2,100 ng/mL 자동차 벤드짐, 100ng/mL 카벤다임 멤브레인 나사 캡으로 플라스크를 닫습니다. 버퍼 레시피는 표 1을 참조하십시오.
- 25°C에서 L1을 꺼내 15mL 튜브로 옮기십시오. 원심분리기는 3분 동안 1,900 x g로, 상류체를 제거하고, 2 μL당 L1을 계산합니다.
- OP50(1.1단계에서)을 웜 수에 비례적으로 추가합니다. 예를 들어 500,000개의 웜에 대해 60mL OP50을 추가합니다.
- 총 부피를 300mL로 가져오기 위해 S 기저와 함께 웜 배양을 완료합니다. 150 rpm으로 흔들리는 인큐베이터에서 25°C에서 L4 단계까지 웜 배양을 배양합니다.
- 다음 날, 벌레는 야생 형 L4s의 크기여야합니다. OP50에서 RNAi 박테리아로 변경하려면 6개의 50mL-튜브에서 동물을 수집하고 퇴적물을 제거하고 상체를 제거하십시오. 잔류 OP50 박테리아를 제거하기 위해 M9로 L4s를 세척 : 3 분 동안 1900 x g의 원심 분리기, 상수 제거 및 모든 L4s를 하나의 50 mL 튜브로 옮긴다. 5 μL당 L4를 계산합니다(최소 9회 이상). 젊은 웜 수집에는 두 번 50,000 L4가 필요하며, 숙성된 웜 수집에는 두 번 100,000 L4가 필요합니다.
- 1.2.2.1에 설명된 대로 4개의 펀바흐 문화 플라스크를 준비한다. 또한 각 플라스크에 50 μg/mL 카베니실린과 1mM IPTG의 최종 농도를 추가합니다.
- 관심 유전자에 대한 제어 RNAi 박테리아및 RNAi 박테리아를 추가 (단계 에서 1.1) 웜의 수에 비례적으로: 어린 벌레에 대한 플라스크 당 각 박테리아의 7 mL과 노인 벌레에 대한 플라스크 당 14 mL을 추가합니다.
- 플라스크당 50,000개의 웜을 추가하여 어린 벌레 수집을 위해 플라스크당 100,000개의 웜을 추가하고, 최대 300mL를 채우기 위해 S 기저로 문화를 완성합니다. 25°C 및 150 rpm에서 웜 배양(총 4개)을 배양합니다.
2. C. 예레간 액체 배양의 유지 보수
- 주기적으로 각 액체 배양에서 알리쿼트를 수집하고 유리 슬라이드 (또는 한천 판에) 배치하여 오염이 없는지 확인합니다. 해부 현미경을 사용하여, 특히 성장 단계 도중 배양에 있는 세균성 음식 수준을 확인하십시오. 1.1단계에서 설명된 바와 같이 관심 유전자에 대한 대조군 RNAi 박테리아 및 RNAi 박테리아의 사전 2 L 배양을 미리 준비한다. 필요한 경우 C. elegans 액체 배양에 추가하고 나머지를 4 °C에서 유지합니다.
- 주기적으로 동물이 멸균되어 있는지 확인하십시오. 동물의 대부분은 gonad를 하지 않습니다. 곤-2 돌연변이의 침투에 따라, 일부는 고나달 구조를 중단했을 수 있지만 계란을 가진 동물은 관찰되어야합니다.
스톡 솔루션 | 분량 | 최종 농도 | 댓글/설명 |
S 기저 (500mL: 5.9 g NaCl, 50 mL 1 M 인산염 pH 6) |
200 mL | 1 M 인산염 pH 6: 1 L: 129 g KH2PO4 모노베이직, 52 g K2HPO4 디베이직 무수 |
|
1 M 구연산 pH 6 (400mL: 구연산 모노하이드레이트 13.1g, 134.4 g 트라이 칼륨 구연산 모노 하이드레이트) |
3 mL | 10mM | |
미량 금속 솔루션 (1 L: 1.86 g 에틸렌디아민테트라아세산 (EDTA), 0.69 g FeSO4 · 7 H2O, 0.2 g MnCl2 · 4 H2O, 0.29 g ZnSO4 · 7 H2O, 0.025 g CuSO4 · 5 H2O) |
3 mL | 4°C에서 어둠 속에서 재고 용액을 저장 | |
1 M MgSO4 (500 mL: 123.3 g) | 900 μL | 3 mM | |
1 M CaCl2 (500mL: 73.5g) | 900 μL | 3 mM | |
200 μg/mL 카르벤다짐 (50 mL: 메탄올에서 10 mg) |
150 μL | 100 ng/mL | |
5 mg/mL 콜레스테롤 (100mL: 에탄올0.5g) |
300 μL | 5 μg/mL |
표 1.
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Fernbach culture flask | Corning | 4425-2XL | Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents |
Membrane Screw Cap | Schott | 1E+06 | GL45 |
Nutating Mixer | VWR | 444-0148 | yes |
Separatory funnel | Nalgene | 4300-1000 | Capacity 1,000 ml |
1 ml syringe | BD Plastipak | 3E+05 | |
Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm | BD Microlance 3 | 3E+05 | |
Membrane filters 0.025 µM | Millipore | VSWP04700 | no |
pH strip | Machery-Nagel | 92110 | pH-Fix 0-14 |
Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 5E+09 | Complete Mini EDTA-free tablets |
Octoxynol-9 | Applichem | A1388 | Triton X-100 |
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M1317 | |
Nonylphenylpolyethylenglycol | Applichem | A1694 | Nonidet P40 (NP40) |
DNaseI | Roche | 5E+09 | recombinant, RNase free |
RNaseA | Promega | A7973 | solution |
Total protein blot staining | Thermofisher | S11791 | Sypro Ruby protein blot stain |
Total protein gel staining | Thermofisher | S12001 | Sypro Ruby protein gel stain |
TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride) | Serva | 36970 | |
Iodoacetamide | Serva | 26710 | |
Ammoniumbicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
Isobaric tags for relative and absolute quantitation | Sciex | 4E+06 | iTRAQ Reagents Multiplex Kit |
Centrifuge Avanti J-26XP | Beckmann Coulter | 4E+05 | |
Ultracentrifuge Optima Max-XP | Beckmann Coulter | 4E+05 | |
Centrifuge 5424R | Eppendorf | 5E+09 | |
Centrifuge 5702 | Eppendorf | 6E+09 | |
Centrifuge Megafuge 40R | Thermo Scientific | 8E+07 | |
Concentrator Plus | Eppendorf | 5E+09 | Centrifugal evaporator |
Fluorescent stereo-microscope M165 FC | Leica | With Planapo 2.0x objective | |
Dissection microscope | Leica | Leica S6E | |
High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1 | Zeiss | With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm | |
Software | |||
Image analysis software | ImageJ | ||
Analysis of mass spectrometry data | Protein Prospector | http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm | no |
E.coli strains | |||
OP50 | CGC | ||
RNAi bacteria | |||
L4440 | Julie Ahringer RNAi library | ||
C. elegans mutants | |||
CF2253 | CGC, strain name: EJ1158 | Genotype: gon-2(q388) | |
C. elegans transgenics | |||
DCD214 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] | |
DCD215 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] |