Overview
RNAiは 、C.エレガンスの 研究者が利用できる強力な遺伝的ツールです。このビデオでは、液体培養条件を利用してプレート給餌よりもRNAiで多くのワームを治療する方法を紹介します。
Protocol
このプロトコルは、Grohらからの抜粋であり、カエノハブディティス・エレガンスの年齢に伴う固有のタンパク質凝集の変化を研究する方法、J. Vis. Exp.(2017).
1. 目的遺伝子を標的とするRNAiを受ける若年動物を収集する生殖腺レス動物の液体培養
注: RNAiに対するいくつかの遺伝子の応答は、前述のように温度依存性であり得る。RNAiの代替として、変異遺伝子をgon-2(-)バックグラウンドに組み込むことができます。
- 液体培養用細菌の製造
- OP50およびRNAi細菌(望ましいdsRNAを産生する細菌および空のベクターをコントロールとして細菌)を、各細菌培養物の12mL(RNAi細菌培養物に50μg/mLカルベニシリンおよび1mM IPTGの最終濃度を加える)を接種して、それらを180rpmで一晩で37°Cでインキュベートする。
- 翌日、4°Cで10分間、6,700xgで培養物を収穫します。 上清を取り除き、60 mL氷冷S基底媒体(100 mM NaCl、50 mMリン酸カリウムpH6、氷上に保つ)で各ペレットを再懸濁します。3つの再懸濁されたペレット(OP50、コントロールRNAi細菌、および目的遺伝子のRNAi細菌)をステップ1.2まで4°Cに保ちます。
注: ワームは、L1段階からRNAi上で増殖させることができるか、最後の幼虫段階L4からの発達上の欠陥を避けるために(ステップ1.2を参照)。
- 最後の幼虫段階L4で始まるRNAiによる処置のための液体培養
- フェルンバッハの培養フラスコ(容量2,800 mL)に200 mL S基底メディアを加えます。300 mL の最終培養量 (1.2.2.4 参照) の場合は、10 mM のクエン酸カリウムを加え、 pH 6,3 mL 微量金属溶液(5mMエチレンアミンテトラ酢酸(EDTA)、2.5mM FeSO 4、1 mM MnCl2、1mM ZnSO 4、0.1 mM CuSO4、3mM MgSO4、3mM CaCl2、100ng/mLカラジン、および5μg/mLコレステロール。膜スクリューキャップでフラスコを閉じます。バッファのレシピについては、表1を参照してください。
- L1を25°Cから取り出し、15 mLチューブに移します。遠心分離機 1,900 x g で 3 分間、上清を取り除き、L1s/2 μLを数え、前のステップで調製したファーンバッハ培養フラスコに 500,000 L1 を加えます。
- OP50 (ステップ 1.1 から) をワームの数に比例して追加します。たとえば、500,000 ワームの場合、60 mL OP50 が追加されます。
- S基底を備えたワーム培養を完了し、総容積を300 mLにします。150rpmで振るインキュベーターで25°CでL4段階になるまでワーム培養をインキュベートする。
- 翌日、ワームは野生型L4の大きさでなければなりません。OP50からRNAi細菌に変えるには、50mLチューブ6個の動物を集め、堆積液を取り除き、上清を取り除きます。M9でL4を洗浄して残留OP50細菌を除去します:1900 x gの遠心分離機を3分間、上清を取り除き、すべてのL4を1つの50 mLチューブに移します。L4を5μLあたりに数えます(少なくとも9回)。若いワームコレクションには2倍の50,000 L4が必要で、老朽化したワームコレクションには2倍の100,000 L4が必要です。
- 1.2.2.1 で説明した 4 つのフェルンバッハ文化フラスコを準備します。また、各フラスコに50 μg/mLカルベニシリンと1 mM IPTGの最終濃度を加えます。
- 目的の遺伝子(ステップ1.1から)の制御RNAi細菌とRNAi細菌をワームの数に比例して追加する:若いワームのフラスコあたり各細菌の7 mLと老朽化したワームのフラスコあたり14 mLを追加します。
- 若いワームコレクション用にフラスコあたり50,000個のワームを追加し、熟成ワームコレクションのためにフラスコあたり100,000ワームを追加し、最大300 mLを満たすためにS基底で培養を完了します。25°Cおよび150rpmでワーム培養物(合計4個)をインキュベートする。
2. C.エレガンス液培養の維持
- 各液体培養物から定期的にアリコートを収集し、ガラススライド(代わりに寒天プレート)に置き、汚染がないことを確認します。解剖顕微鏡を用いて、特に成長段階で培養中の細菌性食品レベルを確認する。ステップ1.1に記載されているように目的の遺伝子に対して制御RNAi細菌およびRNAi細菌の2L培養を予め準備する。必要に応じてC.エレガンス液培養液にこれらを加え、残りを4°Cに保ちます。
- 動物が滅菌であることを定期的に確認してください。動物の大半は生殖腺を持っていません。gon-2突然変異の浸透性に応じて、一部の人は性腺構造を中絶したかもしれないが、卵を持つ動物は観察されるべきではない。
| ストックソリューション | 量 | 最終濃度 | コメント/説明 |
| S基底 (500 mL の場合: 5.9 g NaCl, 50 mL 1 M リン酸カリウム pH 6) |
200 mL | 1 M リン酸カリウム pH 6: 1 L: 129 g KH2PO4 モノベーシック, 52 g K2HPO4 dibasic無水 |
|
| 1 M クエン酸カリウム pH 6 (400 mLの場合:13.1 gクエン酸一水和物、 134.4 g クエン酸トリカリウム一水和物) |
3 mL | 10mM | |
| 微量金属溶液 (1 L:1.86 g エチレンジアミント酢酸(EDTA) 0.69 g FeSO4 ·7 H2O, 0.2 g MnCl2 ·4 H2O, 0.29 g ZnSO4 ·7 H2O, 0.025 g CuSO4 ·5 H2O) |
3 mL | 4 °Cで暗闇の中で在庫液を保管 | |
| 1 M MgSO4 (500 mLの場合:123.3 g) | 900 μL | 3 mM | |
| 1 M CaCl2 (500 mLの場合:73.5 g) | 900 μL | 3 mM | |
| 200 μg/mL カルベンダジン (50 mLの場合:メタノール10mg) |
150 μL | 100 ng/mL | |
| 5 mg/mL コレステロール (100 mLの場合:エタノール中0.5g) |
300 μL | 5 μg/mL |
表 1.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fernbach culture flask | Corning | 4425-2XL | Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents |
| Membrane Screw Cap | Schott | 1E+06 | GL45 |
| Nutating Mixer | VWR | 444-0148 | yes |
| Separatory funnel | Nalgene | 4300-1000 | Capacity 1,000 ml |
| 1 ml syringe | BD Plastipak | 3E+05 | |
| Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm | BD Microlance 3 | 3E+05 | |
| Membrane filters 0.025 µM | Millipore | VSWP04700 | no |
| pH strip | Machery-Nagel | 92110 | pH-Fix 0-14 |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 5E+09 | Complete Mini EDTA-free tablets |
| Octoxynol-9 | Applichem | A1388 | Triton X-100 |
| 4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M1317 | |
| Nonylphenylpolyethylenglycol | Applichem | A1694 | Nonidet P40 (NP40) |
| DNaseI | Roche | 5E+09 | recombinant, RNase free |
| RNaseA | Promega | A7973 | solution |
| Total protein blot staining | Thermofisher | S11791 | Sypro Ruby protein blot stain |
| Total protein gel staining | Thermofisher | S12001 | Sypro Ruby protein gel stain |
| TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride) | Serva | 36970 | |
| Iodoacetamide | Serva | 26710 | |
| Ammoniumbicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| Isobaric tags for relative and absolute quantitation | Sciex | 4E+06 | iTRAQ Reagents Multiplex Kit |
| Centrifuge Avanti J-26XP | Beckmann Coulter | 4E+05 | |
| Ultracentrifuge Optima Max-XP | Beckmann Coulter | 4E+05 | |
| Centrifuge 5424R | Eppendorf | 5E+09 | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 6E+09 | |
| Centrifuge Megafuge 40R | Thermo Scientific | 8E+07 | |
| Concentrator Plus | Eppendorf | 5E+09 | Centrifugal evaporator |
| Fluorescent stereo-microscope M165 FC | Leica | With Planapo 2.0x objective | |
| Dissection microscope | Leica | Leica S6E | |
| High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1 | Zeiss | With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm | |
| Software | |||
| Image analysis software | ImageJ | ||
| Analysis of mass spectrometry data | Protein Prospector | http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm | no |
| E.coli strains | |||
| OP50 | CGC | ||
| RNAi bacteria | |||
| L4440 | Julie Ahringer RNAi library | ||
| C. elegans mutants | |||
| CF2253 | CGC, strain name: EJ1158 | Genotype: gon-2(q388) | |
| C. elegans transgenics | |||
| DCD214 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] | |
| DCD215 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] |
