Alimentazione RNAi nella coltura liquida: un metodo ad alta produttività per abbattere l'espressione genica in C. elegans

Overview

RNAi è un potente strumento genetico a disposizione dei ricercatori di C. elegans. Questo video introduce un metodo per trattare più vermi con RNAi rispetto all'alimentazione delle lastre utilizzando condizioni di coltura liquida.

Protocol

Questo protocollo è un estratto da Groh et al, Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2017).

1. Coltura liquida di animali senza gonadi per raccogliere animali giovani e anziani sottoposti a RNAi mirati a un gene di interesse

NOTA: La risposta di alcuni geni a RNAi può dipendere dalla temperatura come descritto in precedenza. Come alternativa alla RNAi, un gene mutante potrebbe essere incorporato nello sfondo gon-2(-).

1. Preparazione di batteri per la coltura liquida
   1. Preparare i batteri OP50 e RNAi (batteri che producono il dsRNA desiderato e batteri con il vettore vuoto come controllo) inoculando 4 LB medium con 12 mL della rispettiva coltura batterica (aggiungere una concentrazione finale di 50 μg/mL di carbenicillina e 1 mM IPTG alle colture batteriche RNAi) e incubarli a 37 °C durante la notte a 180 giri/min.
   2. Il giorno dopo raccogliere le colture a 6.700 x g per 10 min a 4 °C. Rimuovere i supernaganti e risospendire ogni pellet in mezzi basali S ghiacciati da 60 mL (100 mM NaCl, 50 mM Fosfato di potassio pH 6, tenuto sul ghiaccio). Mantenere i tre pellet rimorsi (OP50, controllare i batteri RNAi e i batteri RNAi per il gene di interesse) a 4 °C fino al passaggio 1.2.
      NOTA: I vermi possono essere coltivati su RNAi dallo stadio L1 o per evitare difetti di sviluppo dall'ultimo stadio larvale L4 (vedi fase 1.2).
2. Coltura liquida per il trattamento con RNAi a partire dall'ultima fase larvale L4
   1. Aggiungere mezzi basali da 200 mL S in un pallone della coltura di Fernbach (capacità 2.800 mL). Per un volume finale di coltura di 300 mL (vedi 1.2.2.4), aggiungere 10 mM di citrato di potassio, pH 6, Soluzione di metalli traccia da 3 mL (acido etilendiamminatetraacetico da 5 mM (EDTA), 2,5 mM FeSO₄, 1 mM MnCl₂, 1 mM ZnSO₄, 0,1 mM CuSO₄), 3 mM MgSO₄, 3 mM CaCl₂, 100 ng/mL carbendazim e 5 μg/mL colesterolo). Chiudere il pallone con un tappo a vite a membrana. Fare riferimento alla tabella 1 per le ricette di tamponi.
   2. Togliere gli L1 da 25 °C e trasferirli in tubi da 15 ml. Centrifugare a 1.900 x g per 3 min, rimuovere il supernatante e contare l'L1 per 2 μL. Aggiungere 500.000 L1 nel pallone della coltura di Fernbach preparato nella fase precedente.
   3. Aggiungere OP50 (dal passaggio 1.1) proporzionalmente al numero di worm. Ad esempio, per 500.000 worm aggiungere 60 mL OP50.
   4. Coltura completa del verme con basale S per portare il volume totale a 300 mL. Incubare la coltura del verme fino allo stadio L4 a 25 °C in un'incubatrice tremante con 150 giri/min.
   5. Il giorno dopo, i vermi dovrebbero essere delle dimensioni di L4 di tipo selvaggio. Per passare dai batteri OP50 a RNAi, raccogliere gli animali in sei tubi da 50 ml, lasciarli sedimentare e rimuovere il supernatante. Lavare gli L4 con M9 per rimuovere i batteri OP50 residui: centrifugare a 1900 x g per 3 min, rimuovere il supernatante e trasferire tutti gli L4 in un tubo da 50 mL. Contare gli L4 per 5 μL (almeno nove volte). Per la raccolta dei giovani vermi sono necessari due volte 50.000 L4 e sono necessari due volte 100.000 L4 per la raccolta dei vermi invecchiati.
   6. Preparare quattro fiasche della coltura di Fernbach come descritto al punto 1.2.2.1. Aggiungere anche una concentrazione finale di 50 μg/mL carbenicillina e 1 mM IPTG ad ogni pallone.
   7. Aggiungere i batteri RNAi di controllo e i batteri RNAi per il gene di interesse (dal passaggio 1.1) proporzionalmente al numero di vermi: aggiungere 7 ml dei rispettivi batteri per pallone per i giovani vermi e 14 ml per pallone per i vermi invecchiati.
   8. Aggiungere 50.000 vermi per pallone per la raccolta dei giovani vermi e 100.000 vermi per pallone per la raccolta dei vermi invecchiati e completare le colture con basale S per riempire fino a 300 mL. Incubare le colture di vermi (quattro in totale) a 25 °C e 150 giri/min.

2. Mantenimento delle colture liquide C. elegans

1. Raccogliere periodicamente un'aliquota da ogni coltura liquida e posizionarlo su uno scivolo di vetro (in alternativa su una piastra di agar) per verificare che non vi siano contaminazioni. Utilizzando un microscopio a dissezione, controllare i livelli di cibo batterico nella coltura soprattutto durante la fase di crescita. Preparare in anticipo 2 colture L di batteri RNAi di controllo e batteri RNAi per il gene di interesse come descritto nella fase 1.1. Aggiungere queste a colture liquide C. elegans se necessario e mantenere il resto a 4 °C.
2. Controllare periodicamente che gli animali siano sterili. La maggior parte degli animali non avrà un gonad. A seconda della penetranza della mutazione gon-2, alcuni possono aver abortito le strutture gonadali ma non dovrebbero essere osservati animali con uova.

Soluzione stock	importo	Concentrazione finale	Commenti/Descrizione
S basale (per 500 mL: 5,9 g NaCl, 50 mL 1 M Fosfato di potassio pH 6)	200 mL		1 M Fosfato di potassio pH 6: Per 1 L: 129 g KH2PO4 monobasico, 52 g K2HPO4 dibasico anidro
1 M Citrato di potassio pH 6 (Per 400 mL: 13,1 g di acido citrico monoidrato, 134,4 g tri-potassio citrato monoidrato)	3 mL	10 mM
Soluzione di metalli traccia (Per 1 L: 1,86 g acido etilendiamminatetraacetico (EDTA), 0,69 g FeSO4 · 7 H2O, 0,2 g MnCl2 · 4 H2O, 0,29 g ZnSO4 · 7 H2O, 0,025 g CuSO4 · 5 H2O)	3 mL		Conservare la soluzione stock al buio a 4 °C
1 M MgSO4 (per 500 mL: 123,3 g)	900 μL	3 mM
1 M CaCl2 (per 500 mL: 73,5 g)	900 μL	3 mM
200 μg/mL Carbendazim (Per 50 mL: 10 mg in metanolo)	150 μL	100 ng/mL
5 mg/mL Colesterolo (Per 100 mL: 0,5 g in etanolo)	300 μL	5 μg/mL

La tabella 1.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fernbach culture flask	Corning	4425-2XL	Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents
Membrane Screw Cap	Schott	1E+06	GL45
Nutating Mixer	VWR	444-0148	yes
Separatory funnel	Nalgene	4300-1000	Capacity 1,000 ml
1 ml syringe	BD Plastipak	3E+05
Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm	BD Microlance 3	3E+05
Membrane filters 0.025 µM	Millipore	VSWP04700	no
pH strip	Machery-Nagel	92110	pH-Fix 0-14
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	5E+09	Complete Mini EDTA-free tablets
Octoxynol-9	Applichem	A1388	Triton X-100
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	M1317
Nonylphenylpolyethylenglycol	Applichem	A1694	Nonidet P40 (NP40)
DNaseI	Roche	5E+09	recombinant, RNase free
RNaseA	Promega	A7973	solution
Total protein blot staining	Thermofisher	S11791	Sypro Ruby protein blot stain
Total protein gel staining	Thermofisher	S12001	Sypro Ruby protein gel stain
TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride)	Serva	36970
Iodoacetamide	Serva	26710
Ammoniumbicarbonate	Sigma-Aldrich	9830
Sequencing Grade Modified Trypsin	Promega	V5111
Isobaric tags for relative and absolute quantitation	Sciex	4E+06	iTRAQ Reagents Multiplex Kit
Centrifuge Avanti J-26XP	Beckmann Coulter	4E+05
Ultracentrifuge Optima Max-XP	Beckmann Coulter	4E+05
Centrifuge 5424R	Eppendorf	5E+09
Centrifuge 5702	Eppendorf	6E+09
Centrifuge Megafuge 40R	Thermo Scientific	8E+07
Concentrator Plus	Eppendorf	5E+09	Centrifugal evaporator
Fluorescent stereo-microscope M165 FC	Leica		With Planapo 2.0x objective
Dissection microscope	Leica		Leica S6E
High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1	Zeiss		With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm
Software
Image analysis software	ImageJ
Analysis of mass spectrometry data	Protein Prospector	http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm	no
E.coli strains
OP50	CGC
RNAi bacteria
L4440	Julie Ahringer RNAi library
C. elegans mutants
CF2253	CGC, strain name: EJ1158	Genotype: gon-2(q388)
C. elegans transgenics
DCD214	Della David's lab at DZNE Tübingen	Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]
DCD215	Della David's lab at DZNE Tübingen	Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]