Sıvı Kültüründe RNAi Besleme: C. elegans'ta Gen Ekspresyonini Devirmek için Yüksek Verimli Bir Yöntem

Overview

RNAi, C. elegans araştırmacıları için güçlü bir genetik araçtır. Bu video, sıvı kültür koşullarından yararlanarak plaka beslemesinden daha fazla solucanı RNAi ile tedavi etmek için bir yöntem sunar.

Protocol

Bu protokol Groh ve ark, Caenorhabditis elegans, J. Vis. ExpYaş ile Doğal Protein Toplama Değişiklikleri Çalışma Yöntemleri bir alıntıdır. (2017).

1. İlgi çekici bir geni hedef alan RNAi'ye maruz kalan genç ve yaşlı hayvanları toplamak için gonadsız hayvanların sıvı kültürü

NOT: Bazı genlerin RNAi'ye yanıtı daha önce açıklandığı gibi sıcaklığa bağlı olabilir. RNAi'ye alternatif olarak, gon-2(-) arka planına bir mutant geni dahil edilebilir.

1. Sıvı kültürü için bakterilerin hazırlanması
   1. OP50 ve RNAi bakterilerini (kontrol olarak boş vektörle istenen dsRNA ve bakterileri üreten bakteriler) ilgili bakteri kültürünün 12 mL'si ile 4 L LB ortam aşılayarak hazırlayın (bir son ekleyin RNAi bakteri kültürlerine 50 μg/mL karbenisilin ve 1 mM IPTG konsantrasyonu) ve 180 rpm'de bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
   2. Ertesi gün kültürleri 4 °C'de 10 dakika boyunca 6.700 x g'da hasat edin. Süpernatantları çıkarın ve her peleti 60 mL buz gibi S bazal ortama yeniden koyun (100 mM NaCl, 50 mM Potasyum fosfat pH 6, buzda tutulur). 1.2. adıma kadar üç resüspended pelet (OP50, RNAi bakterilerini kontrol edin ve RNAi bakterilerini ilgi geni için 4 °C'de tutun).
      NOT: Solucanlar RNAi'de L1 aşamasından veya son larva aşaması L4'ten gelişimsel kusurları önlemek için yetiştirilebilir (bkz. adım 1.2).
2. Son larva evresi L4'ten başlayarak RNAi ile tedavi için sıvı kültürü
   1. Fernbach kültür şişesinde (kapasite 2.800 mL) 200 mL S bazal ortam ekleyin. 300 mL'lik son kültür hacmi için (bkz. 1.2.2.4), 10 mM potasyum sitrat ekleyin, pH 6, 3 mL İz metal çözeltisi (5 mM etileniaminetetraasetik asit (EDTA), 2,5 mM FeSO₄, 1 mM MnCl_2,1 mM ZnSO₄, 0.1 mM CuSO₄), 3 mM MgSO₄, 3 mM CaCl₂, 100 ng/mL carbendazim ve 5 μg/mL kolesterol). Matarayı bir membran vida kapağı ile kapatın. Arabellek tarifleri için Tablo 1'e bakın.
   2. L1'leri 25 °C'den alın ve 15 mL tüplere aktarın. 3 dakika boyunca 1.900 x g'da santrifüj, süpernatantı çıkarın ve 2 μL başına L1'leri sayın.
   3. OP50'yi (adım 1.1'den itibaren) solucan sayısına orantılı olarak ekleyin. Örneğin, 500.000 solucan için 60 mL OP50 ekleyin.
   4. Toplam hacmi 300 mL'ye çıkarmak için S bazal ile solucan kültürünü tamamlayın. Solucan kültürünü 25 °C'de L4 aşamasına kadar 150 rpm'lik sallanan bir inkübatörde kuluçkaya yatırın.
   5. Ertesi gün, solucanlar vahşi tip L4'ler büyüklüğünde olmalıdır. OP50'den RNAi bakterisine değişmek için, hayvanları altı adet 50 mL tüpte toplayın, tortuya izin verin ve süpernatantı çıkarın. Artık OP50 bakterilerini temizlemek için L4'leri M9 ile yıkayın: 3 dakika boyunca 1900 x g'da santrifüj, süpernatantı çıkarın ve tüm L4'leri tek bir 50 mL tüpe aktarın. L4'leri 5 μL başına (en az dokuz kez) sayın. Genç solucan koleksiyonu için iki kez 50.000 L4, yaşlı solucan toplama için ise iki kez 100.000 L4 gereklidir.
   6. 1.2.2.1'de açıklandığı gibi dört Fernbach kültür şişesi hazırlayın. Ayrıca her şişeye 50 μg/mL Karbenisilin ve 1 mM IPTG son konsantrasyon ekleyin.
   7. İlgi geni için kontrol RNAi bakterilerini ve RNAi bakterilerini (adım 1.1'den) solucan sayısına orantılı olarak ekleyin: Genç solucanlar için şişe başına ilgili bakterilerin 7 mL'si ve yaşlı solucanlar için şişe başına 14 mL ekleyin.
   8. Genç solucan koleksiyonu için şişe başına 50.000 solucan ve yaşlı solucan koleksiyonu için şişe başına 100.000 solucan ekleyin ve kültürleri 300 mL'ye kadar doldurmak için S bazal ile tamamlayın. Solucan kültürlerini (toplamda dört) 25 °C ve 150 rpm'de kuluçkaya yaslanın.

2. C. elegans sıvı kültürlerinin bakımı

1. Her sıvı kültüründen periyodik olarak bir aliquot toplayın ve kirlenme olmadığını doğrulamak için bir cam kaydırağa (alternatif olarak bir agar plakasına) yerleştirin. Diseksiyon mikroskobu kullanarak, özellikle büyüme aşamasında kültürdeki bakteriyel gıda seviyelerini kontrol edin. Adım 1.1'de açıklandığı gibi, ilgi genine 2 L kontrol RNAi bakterisi ve RNAi bakterisi hazırlayın. Gerekirse bunları C. elegans sıvı kültürlerine ekleyin ve geri kalanını 4 °C'de tutun.
2. Hayvanların steril olup olmadığını periyodik olarak kontrol edin. Hayvanların çoğunluğunun bir gonad'ı olmayacaktır. Gon-2 mutasyonunun penetrance bağlı olarak, bazıları gonadal yapıları iptal etmiş olabilir, ancak yumurtalı hayvanlar gözlenmemelidir.

Stok çözümü	Tutar	Son konsantrasyon	Açıklamalar/Açıklama
S bazal (500 mL için: 5,9 g NaCl, 50 mL 1 M Potasyum fosfat pH 6)	200 mL		1 M Potasyum fosfat pH 6: 1 L için: 129 g KH2PO4 monobasik, 52 g K2HPO4 dibasik susuz
1 M Potasyum sitrat pH 6 (400 mL için: 13.1 g sitrik asit monohidrat, 134,4 g tri-potasyum sitrat monohidrat)	3 mL	10 mM
eser metaller çözümü (1 L için: 1.86 g Etilenediaminetetraasetik asit (EDTA), 0,69 g FeSO4 · 7 H2O, 0,2 g MnCl2 · 4 H2O, 0,29 g ZnSO4 · 7 H2O, 0.025 g CuSO4 · 5 H2O)	3 mL		Stok soluyu karanlıkta 4 °C'de saklayın
1 M MgSO4 (500 mL için: 123,3 g)	900 μL	3 mM
1 M CaCl2 (500 mL için: 73,5 g)	900 μL	3 mM
200 μg/mL Carbendazim (50 mL için: Metanolde 10 mg)	150 μL	100 ng/mL
5 mg/mL Kolesterol (100 mL için: Etanolde 0,5 g)	300 μL	5 μg/mL

Tablo 1.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fernbach culture flask	Corning	4425-2XL	Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents
Membrane Screw Cap	Schott	1E+06	GL45
Nutating Mixer	VWR	444-0148	yes
Separatory funnel	Nalgene	4300-1000	Capacity 1,000 ml
1 ml syringe	BD Plastipak	3E+05
Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm	BD Microlance 3	3E+05
Membrane filters 0.025 µM	Millipore	VSWP04700	no
pH strip	Machery-Nagel	92110	pH-Fix 0-14
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	5E+09	Complete Mini EDTA-free tablets
Octoxynol-9	Applichem	A1388	Triton X-100
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)	Sigma-Aldrich	M1317
Nonylphenylpolyethylenglycol	Applichem	A1694	Nonidet P40 (NP40)
DNaseI	Roche	5E+09	recombinant, RNase free
RNaseA	Promega	A7973	solution
Total protein blot staining	Thermofisher	S11791	Sypro Ruby protein blot stain
Total protein gel staining	Thermofisher	S12001	Sypro Ruby protein gel stain
TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride)	Serva	36970
Iodoacetamide	Serva	26710
Ammoniumbicarbonate	Sigma-Aldrich	9830
Sequencing Grade Modified Trypsin	Promega	V5111
Isobaric tags for relative and absolute quantitation	Sciex	4E+06	iTRAQ Reagents Multiplex Kit
Centrifuge Avanti J-26XP	Beckmann Coulter	4E+05
Ultracentrifuge Optima Max-XP	Beckmann Coulter	4E+05
Centrifuge 5424R	Eppendorf	5E+09
Centrifuge 5702	Eppendorf	6E+09
Centrifuge Megafuge 40R	Thermo Scientific	8E+07
Concentrator Plus	Eppendorf	5E+09	Centrifugal evaporator
Fluorescent stereo-microscope M165 FC	Leica		With Planapo 2.0x objective
Dissection microscope	Leica		Leica S6E
High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1	Zeiss		With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm
Software
Image analysis software	ImageJ
Analysis of mass spectrometry data	Protein Prospector	http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm	no
E.coli strains
OP50	CGC
RNAi bacteria
L4440	Julie Ahringer RNAi library
C. elegans mutants
CF2253	CGC, strain name: EJ1158	Genotype: gon-2(q388)
C. elegans transgenics
DCD214	Della David's lab at DZNE Tübingen	Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]
DCD215	Della David's lab at DZNE Tübingen	Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1]