Drosophila Optogenetics: En metode til at manipulere neuronale kredsløb

Overview

Optogenetics gør det muligt at bruge lys til at manipulere neuroner, der er genetisk manipuleret til at udtrykke specifikke opsins-lysfølsomme proteiner, hvis lysaktivering udløser en ændring i neuronens tilstand. Her beskriver vi en optogenetisk tilgang i Drosophila ved hjælp af opsin Channelrhodopsin2. Eksempelprotokollen indeholder en optogenetics assay indstillet til at studere neuronale kredsløb bag fluens flugtadfærd.

Protocol

Denne protokol er et uddrag fra de Vries og Clandinin, Optogenetic Stimulation of Escape Behavior i Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2013).

1. Generer Channelrhodopsin Fluer

1. Cross UAS-ChR2 flyver med Gal4 føreren efter eget valg, vi bruger G105-Gal4, som udtrykkes i Foma-1 neuroner i den optiske lap.
2. For at eliminere muligheden for en visuel reaktion på det blå lys stimulation, begge flyve linjer er i en w⁺norpA baggrund.
3. Slutresultat: w⁺norpA; G105-Gal4/UAS-ChR2 +
4. Efter voksne fluer eclose, sætte udvalgte kvinder på frisk mad, suppleret med 10 μM all-trans-nethinde (en co-faktor, der kræves for ChR2) og beskyttet mod lys, i 3 dage før de udfører adfærdsmæssige analyse.

2. Lav 10 μM all-trans-nethindeforbedret foder

1. 100 mg trans-nethinde opløses i 17,6 ml 95% ethanol for at fremstille 20 mM nethinde. Hold alle-trans-nethinde beskyttet mod lys på alle tidspunkter.
2. Smelt standard cornmeal flyve mad i mikrobølgeovn, og lad afkøle indtil varm at røre ved.
3. Der blandes 50 μl på 20 mM alt trans-nethinde i hætteglas med 10 ml fluefoder.
4. Lad hætteglas køle af og hold beskyttet mod lys.

3. Udstyr

1. Pipetspidser: Standard 1.000 μl pipetspidser skæres nær spidsen, hvilket skaber en porediameter på ~ 2,25 mm.
2. Platform (se figur 1).
   1. En Delrin base, 17 cm X 25 cm, blev konstrueret med gevindhuller i hvert hjørne til at passe 1 / 4 "NPT kølevæske slange stik.
   2. En lodret holder, lavet af Delrin, er fastgjort til midten af basen. De samlede dimensioner er 25 mm X 40 mm X 65 mm (bredde X dybde X højde). En 10 mm bred rille løber holderens længde med en tommelfingerskrue i bunden. En platform er fastgjort til toppen af holderen, 25 mm X 40 mm X 10 mm, med et hul med en diameter på 3,5 mm justeret med rillen i holderen.
3. LED-arrays (se figur 1).
   1. Fire arme kølevæskeslange, ~ 18 cm lange, er fastgjort til platformbasen ved hjælp af kølevæskeslangestikket. Kølevæskeslangen bruges kun som strukturel støtte og bruges ikke til køleformål.
   2. Korrekt afstand riller skæres i det sidste stykke kølevæske spuling af hver arm til at anbringe en køleplade til enden af hver arm.
   3. En blå LED Rebel Tri-Stars er monteret på hver køleplade ved hjælp af forskåret termisk tape. En Carclo 18 ° Tri-linse er fastgjort til hver Tri-Star.
   4. LED Tri-Stars er forbundet til BuckPuck DC-driverne og en strømforsyning som angivet. Vi har arrangeret vores set-up med hver BuckPuck kraftering to Tri-Stars i serie.
   5. Belysning af alle fire LED Tri-Stars ved 700 mA gav en bestråling på 713 W/m² på vores platform.
4. Kamera: Kameraet er monteret på et lille stativ og fokuseret på toppen af platformen.

4. Adfærdsmæssige Assay

1. Kort bedøve fluer på is.
2. Placer individuelle fluer i pipetspidser ved hjælp af tape til at lukke begge ender af spidsen.
3. Når fluerne er vågnet og aktivt udforsker pipetspidsen, skal du fjerne båndet og placere en pipet i rillen i lodret holder. Tommelfingerskruen bruges til at fastgøre pipetspidsen på plads og til at lukke bunden af spidsen.
4. Når fluen udforsker pipetspidsen (typisk 30 - 60 sek.), skal du starte kameraoptagelsen lige før fluen kommer ud af spidsen på platformen.
5. Når fluen er opstået på platformen, skal du vente 1-2 sekunder og tænde de blå lysdioder. Brug en timer til manuelt at måle tiden, indtil fluen starter flyvningen.

Representative Results

Figur 1: Eksperimentel opsætning, der viser platformen med den lodrette holder og de fire kølearme, der holder kølelegeme med LED-arrays fastgjort til dem. (A)Opsætningen under omgivende belysning. (B) Opsætningen, når LED'erne lyser. (C) Et nærbillede af en Tri-Star LED på kølelegemet. (D) Et nærbillede af Tri-Star med tri-linsen fastgjort. (E)En skematisk af Buckpuck Driver og LED kredsløb. (F)Kredsløbsdiagram for BuckPuck- og LED-kredsløbet. Klik her for at se en større version af dette tal.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
All-trans Retinal	Advance Scientific Chemical Inc	R3041
Equipment
Heat Sink 9.2 C/W	Luxeonstar	LPD30-30B	30 mm square X 30 mm high
Carclo 18° Tri-Lens	Luxeonstar	10507
Blue Rebel LED on Tri-Star Base	Luxeonstar	MR-B0030-20T	470 nm, 174 lm @ 700 mA.
700 mA BuckPuck DC Driver	Luxeonstar	3021-D-E-700
Wiring Harness for BuckPuck Driver	Luxeonstar	3021-HE
Pre-cut thermal adhesive tape	Luxeonstar	LXT-S-12	20 mm Hex Base
Snap-Loc Coolant Hose, ¼" ID	McMaster-Carr	5307K49
Snap-Loc Coolant Hose Connector	McMaster-Carr	5307K39	¼" NPT Male
Laboratory Grade Switching Mode Programmable DC Power Supply	BK Precision	1698
Exilim camera	Casio	EX-FH20