Digestion enzymatique et dissociation manuelle : une méthode pour préparer les embryons de C. elegans à la culture cellulaire

Overview

Cette vidéo introduit une méthode pour isoler et culturer stérilement les cellules embryonnaires de C. elegans in vitro.

Protocol

1. Dissociation des cellules embryonnaires

1. Effectuer les prochaines étapes de la procédure dans des conditions stériles à l’aide d’un capot d’écoulement laminaire. Alors que les animaux sont robe sur les plaques de bactéries, les lavages et le traitement avec la solution de lyse contenant de l’eau de Javel devrait éliminer la plupart sinon toutes les bactéries. Ainsi, l’utilisation d’une hotte laminaire à ce stade de la procédure empêche une nouvelle contamination de la suspension de l’œuf.
2. Resuspendez les œufs granulés dans 1 ml de chitinase de 2 mg/ml (bouillon dans le pH tampon des œufs 6,5) et transférez-les dans un nouveau tube conique stérile de 15 ml. Faire basculer le tube de 10 à 30 min à température ambiante. Le temps d’incubation exact change en fonction de la fraîcheur de l’enzyme et de la température de la pièce et doit donc être déterminé pour chaque préparation. Il est recommandé de commencer à surveiller les œufs sous un microscope à culture cellulaire inversée après 10 minutes d’incubation. Remarque : d’après notre expérience, le pH faible augmente l’activité enzymatique chitinase. Pour cette raison, nous utilisons tampon d’oeufs au pH 6,5 pour dissoudre chitinase (recette rapportée ci-dessus, où le pH est ajusté à 6,5 en utilisant NaOH).
3. Lorsque ~ 80% des coquilles d’oeufs sont digérées par le traitement chitinase (Figures 1 A-B), pelleter les oeufs par centrifugation à 900 x g (~2500 rpm) pendant 3 min. À l’aide d’un pipettor P1000 et de pointes stériles, retirer soigneusement le supernatant et ajouter 3 ml de L-15 moyen.
4. Transférer les œufs dans une plaque de 6 cm de diamètre et dissocier délicatement les cellules à l’aide d’une seringue stérile de 10 ml munie d’une aiguille de 18 G. Surveillez le degré de dissociation en plaçant une goutte de suspension dans une boîte de Pétri en plastique frais et en la regardant au microscope. N’aspirez pas l’air dans la seringue pendant cette procédure pour éviter d’endommager les cellules. Poursuivre la dissociation jusqu’à ce qu’environ 80% des cellules soient dissociées.
5. Filtrer la suspension à l’aide d’un filtre millipore stérile de 5 μm. Les suspensions cellulaires doivent être filtrées afin d’éliminer les touffes cellulaires, les œufs non digérés et les larves écloses. Filtrer 4-5 ml supplémentaires de L-15 frais à travers le filtre pour récupérer toutes les cellules. N’utilisez pas une force excessive pendant l’étape de filtration pour éviter d’endommager le filtre et/ou les cellules.

2. Cellules de culture

1. Pelleter les cellules dissociées par centrifugation à 900 x g (~2500 rpm) pendant 3 min. À l’aide d’un pipettor P1000 et de pointes stériles, retirez soigneusement tous les supernatants. Resuspendez les cellules granulées dans le milieu complet de L-15 et plaquez 1 ml/puits. La quantité du milieu ajouté dépend du nombre de plaques 8P utilisées, de la confluence des vers sur les plaques et du type d’expériences qui seront effectuées sur les cellules. La densité cellulaire peut être déterminée à l’aide d’un hémocytomètre. Pour les enregistrements patch-clamp la densité de placage de ~ 230.000 cellules / cm² est optimale.
2. Conservez la plaque de 24 puits dans un contenant tupperware en plastique contenant des serviettes en papier humide pour éviter l’évaporation du milieu de culture. Conserver le contenant dans un incubateur humidifié à 20 °C et l’air ambiant.
3. Les cellules sont généralement prêtes pour les expériences dans les 24 heures lorsque la différenciation morphologique et l’expression des marqueurs GFP sont terminées. Les cellules peuvent être conservées en culture jusqu’à 2 semaines, mais elles sont généralement les plus saines jusqu’à 7-9 jours après le placage. Le milieu doit être remplacé une fois par jour pour maintenir des cellules saines.

Representative Results

Figure 1. Embryons de C. elegans avant et après le traitement de chitinase. (A) Photographie des œufs avant l’exposition à la chitinase. La flèche indique la coquille d’œuf transparente et intacte entourant un embryon. (B) Oeufs traités avec chitinase pendant 10 min. Les coquilles d’œufs ont été digérées et ne sont plus visibles autour des embryons. Les flèches indiquent trois embryons libérés de la coquille d’œuf. La boîte bleue entoure un groupe de cellules qui sont encore attachées les unes aux autres.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid	Invitrogen	11415-064
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	16140-063
Penicillin-streptomycin	Sigma	P4333-100ML
Chitinase from Streptomyces Griseus	Sigma	C6137-25UN
Peanut Lectin	Sigma	L0881-10MG
EQUIPMENT
101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips	USA Scentific	1111-2821
10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped	USA Scentific	1071-0810
Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector	VWR International Inc.	89079-974
Portable Pipet Aid, Drummond	VWR International Inc.	53498-103
Transfer Plastic Pipet Sterile	VWR International Inc.	14670-114
15 ml Conical Tube	USA Scentific	1475-1611
Sterile 18 gauge Needles	Becton, Dickinson and Co.	305196
Sterile 10 ml Syringes	Becton, Dickinson and Co.	305482
Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size	Corning	431224
Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane	VWR International Inc.	28144-095
60x15 mm Petri Dish Sterile	VWR International Inc.	82050-548
100x15 mm Petri Dish Sterile	VWR International Inc.	82050-912
12 mm Diameter Glass Coverslips	VWR International Inc.	48300-560
Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid	Thomas scientific	6902A09
Dumont #5- Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Centrifuge 5702	Eppendorf	22629883
Laminar Flow Hood
Inverted Microscope with x10 objective
Ambient air humidified Incubator