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Digestion enzymatique et dissociation manuelle

 
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Digestion enzymatique et dissociation manuelle : une méthode pour préparer les embryons de C. elegans à la culture cellulaire

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- Commencez par des oeufs granulés qui ont été isolés en blanchissant les vers adultes gravides. Assurez-vous que chaque étape de cette procédure est menée de façon stérile afin d’éviter la contamination des cellules d’culture. Suspendre la pastille dans une solution de chitinase, une enzyme qui décompose la chitine - un grand polysaccharide qui est un composant structurel de la coquille d’œuf.

Après une période de digestion appropriée, centrifugez doucement les œufs et remplacez le supernatant par un milieu de culture cellulaire pour arrêter la digestion. Ensuite, passez les embryons à travers une aiguille de calibre 18 pour séparer mécaniquement les cellules individuelles. Ensuite, filtrez la solution pour enlever les débris de la coquille d’œuf ou des touffes de cellules non séparées. Plaquez les cellules dans un plat de culture sur un bordereau de couverture en verre recouvert d’agglutinine d’arachide - une lectine qui aide les cellules à s’attacher au glissement de couverture en liant les glucides de surface cellulaire.

Dans le protocole d’exemple, nous préparerons des cellules embryonnaires pour la différenciation et l’analyse morphologiques in vitro.

- Tout en travaillant sous un capot d’écoulement laminaire pour éviter d’introduire une contamination bactérienne, resuspendez les œufs granulés en un millilitre de deux milligrammes par chitinase millilitre et transférez-les dans un tube conique frais de 15 millilitres. Rock le tube pendant 10 à 30 minutes à température ambiante, selon la fraîcheur de l’enzyme. Quand environ 80% des coquilles d’oeufs sont digérées, centrifugez les oeufs à 900 g pendant trois minutes.

Après avoir soigneusement enlevé le supernatant, ajouter trois millilitres de L15 moyen. Transférer les œufs dans une plaque de six centimètres de diamètre et commencer la dissociation manuelle à l’aide d’une seringue stérile de 10 millilitres avec une aiguille de calibre 18. Pour surveiller le degré de dissociation, placez une goutte de suspension dans une boîte de Petri fraîche et visualisez-la au microscope. Continuer jusqu’à ce qu’environ 80 % des cellules soient dissociées.

Pour enlever les touffes cellulaires, les œufs non digérés et les larves écloses filtrent doucement la suspension à l’aide d’un filtre de cinq microns et exécutent de quatre à cinq millilitres supplémentaires de L15 à travers le filtre pour récupérer les cellules. Pour faire la culture des cellules après avoir centrifugé le filtrate à 900 g pendant trois minutes, suspendre à nouveau les cellules dans un milieu L15 complet. Plaque un millilitre par puits, et conserver les assiettes dans une chambre humide scellée à 20 degrés Celsius dans l’air ambiant.

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