Digestão Enzimática e Dissociação Manual: Um Método para Preparar embriões C. elegans para cultura celular

Overview

Este vídeo introduz um método para isolar e estéril cultura células C. elegans embrionárias in vitro.

Protocol

1. Dissociação de células embrionárias

1. Conduzir os próximos passos do procedimento em condições estéreis usando uma capa de fluxo laminar. Enquanto os animais estão vestidos em placas de bactérias, as lavagens e o tratamento com a solução de lise contendo alvejante devem eliminar a maioria, se não todas as bactérias. Assim, o uso de um capô laminar neste ponto do procedimento evita uma nova contaminação da suspensão do ovo.
2. Resuspend ovos pelleted em 1 ml de 2 mg/ml chitinase (estoque em pH tampão de ovo 6.5) e transferi-los para um novo tubo cônico estéril de 15 ml. Balance o tubo por 10-30 min em temperatura ambiente. O tempo exato de incubação muda de acordo com o frescor da enzima e da temperatura da sala e, portanto, deve ser determinado para cada preparação. Recomenda-se começar a monitorar os ovos sob um microscópio de cultura celular invertida após 10 minutos de incubação. Nota: em nossa experiência, o pH baixo aumenta a atividade enzimática chitinase. Por esta razão usamos tampão de ovo no pH 6.5 para dissolver chitinase (receita relatada acima, onde o pH é ajustado para 6,5 utilizando NaOH).
3. Quando ~ 80% das cascas de ovos são digeridas pelo tratamento de chitinase(Figuras 1 A-B), pelota os ovos por centrifugação a 900 x g (~2.500 rpm) por 3 min. Usando um pipettor P1000 e pontas estéreis, remova cuidadosamente o supernascente e adicione 3 ml de meio L-15.
4. Transfira os ovos para uma placa de 6 cm de diâmetro e dissociar suavemente as células usando uma seringa estéril de 10 ml equipada com uma agulha de 18 G. Monitore o grau de dissociação colocando uma gota de suspensão em uma placa de Petri de plástico fresco e visualizando sob o microscópio. Não aspire o ar na seringa durante este procedimento para evitar danificar as células. Continue a dissociação até que ~ 80% das células sejam dissociadas.
5. Filtre a suspensão usando um filtro millipore estéril de 5 μm. As suspensões celulares devem ser filtradas para remover aglomerados celulares, ovos não digeridos e larvas eclodidas. Filtre 4-5 ml adicionais de mídia L-15 fresca através do filtro para recuperar todas as células. Não use força excessiva durante a etapa de filtragem para evitar danificar o filtro e/ou as células.

2. Células de cultivo

1. Pelota as células dissociadas por centrifugação a 900 x g (~2.500 rpm) por 3 min. Usando um pipettor P1000 e pontas estéreis remova cuidadosamente todo o supernante. Resuspenque as células pelotas em média L-15 completa e placa 1 ml/poço. A quantidade do meio adicionado depende do número de placas 8P utilizadas, da confluência dos vermes nas placas e do tipo de experimentos que serão realizados nas células. A densidade celular pode ser determinada usando um hemótmetro. Para gravações de grampos de remendo a densidade de revestimento de ~ 230.000 células/cm² é ótima.
2. Mantenha a placa de 24 poços em um recipiente de tupperware plástico contendo toalhas de papel molhadas para evitar a evaporação do meio de cultura. Armazene o recipiente em uma incubadora umidificada a 20 °C e ar ambiente.
3. As células geralmente estão prontas para os experimentos dentro de 24 horas quando a diferenciação morfológica e a expressão dos marcadores GFP estão completas. As células podem ser mantidas na cultura por até 2 semanas, mas geralmente são mais saudáveis até 7-9 dias após o revestimento. O meio precisa ser substituído uma vez por dia para manter células saudáveis.

Representative Results

Figura 1. C. elegans embriões antes e depois do tratamento de chitinase. (A) Fotografia de ovos antes da exposição à chitinase. A seta aponta para a casca de ovo transparente e intacta em torno de um embrião. (B) Ovos tratados com chitinase por 10 min. As cascas de ovos foram digeridas e não são mais visíveis ao redor dos embriões. As flechas apontam para embriões triplos liberados da casca de ovo. A caixa azul envolve um grupo de células que ainda estão presas umas às outras.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid	Invitrogen	11415-064
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	16140-063
Penicillin-streptomycin	Sigma	P4333-100ML
Chitinase from Streptomyces Griseus	Sigma	C6137-25UN
Peanut Lectin	Sigma	L0881-10MG
EQUIPMENT
101-1000 μl Blue Graduated Pipet Tips	USA Scentific	1111-2821
10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped	USA Scentific	1071-0810
Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejector	VWR International Inc.	89079-974
Portable Pipet Aid, Drummond	VWR International Inc.	53498-103
Transfer Plastic Pipet Sterile	VWR International Inc.	14670-114
15 ml Conical Tube	USA Scentific	1475-1611
Sterile 18 gauge Needles	Becton, Dickinson and Co.	305196
Sterile 10 ml Syringes	Becton, Dickinson and Co.	305482
Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size	Corning	431224
Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor Membrane	VWR International Inc.	28144-095
60x15 mm Petri Dish Sterile	VWR International Inc.	82050-548
100x15 mm Petri Dish Sterile	VWR International Inc.	82050-912
12 mm Diameter Glass Coverslips	VWR International Inc.	48300-560
Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid	Thomas scientific	6902A09
Dumont #5- Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-20
Centrifuge 5702	Eppendorf	22629883
Laminar Flow Hood
Inverted Microscope with x10 objective
Ambient air humidified Incubator